Produzione di particelle retrovirali per il trasferimento genico

Abstract

Fonte: Zjablovskaja, P., et al., Proliferazione e Differenziamento di Cellule Precursori Mieloidi Murine 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra la produzione di particelle retrovirali ricombinanti mediante trasfezione di cellule impacchettatrici derivate da rene umano, consentendo la consegna stabile di geni a cellule bersaglio per applicazioni successive come la modificazione genetica, saggi funzionali o studi sulla differenziazione linéaria.

Protocollo

1. Produzione di retrovirus
   1. Piastrellare una sospensione cellulare singola di cellule Bosc23 (6 × 10⁶) in una piastra di Petri da 16 cm e coltivare in 18 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) contenente il 10% di FBS (siero fetale bovino) fino a quando la confluenza della coltura raggiunge l'80% (24 h).
      NOTA: Le cellule devono crescere in un monostrato e non formare aggregati in coltura. Il conteggio cellulare può essere eseguito mediante diversi metodi (valido per il resto dei protocolli presentati qui). In caso di un numero ridotto di campioni, si raccomanda il conteggio manuale al microscopio utilizzando la camera di Bürker. In questo caso, utilizzare il blu di Trypan per escludere le cellule morte. Mescolare le cellule in rapporto 1:1 con blu di Trypan al 0,4% in PBS (soluzione salina tamponata al fosfato). Per eseguire il conteggio di un elevato numero di campioni, può essere impiegato un contatore cellulare automatico.
   2. Combinare 40 µg di costrutto retrovirale (ad esempio MSCV), 20 µg di pCL-Eco (vettore di impacchettamento), 80 µl di PEI (polietilenimina) e 2 mL di mezzo con basso contenuto di siero (ad esempio Opti-MEM (Minimum Essential Medium) (senza antibiotici). Incubare questa miscela per 20 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Sostituire con attenzione il mezzo delle cellule Bosc23 con 16 mL di DMEM integrato con il 2% di FBS. Riscaldare preventivamente il mezzo a 37 °C prima dell'uso.
      NOTA: Non utilizzare antibiotici durante la trasfezione, poiché potrebbero ridurre l'efficienza di trasfezione.
   4. Aggiungere la miscela preparata al punto 1.2 goccia a goccia e con cautela nella coltura Bosc23, e incubare per 4 h a 37 °C. Limitare l'incubazione a meno di 6 h a causa della tossicità del PEI.
   5. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo delle cellule Bosc23 con 18 mL di DMEM preriscaldato contenente il 10% di FBS, e coltivare le cellule per 48 h a 37 °C. Posizionare le piastre in un laboratorio di sicurezza biologica di livello 2 e seguire le procedure standard di sicurezza.
   6. Raccogliere il mezzo delle cellule Bosc23 (contenente particelle retrovirali ecotropiche) utilizzando una pipetta siringa da 25 mL in un tubo conico da 50 mL e conservare a 4 °C.
      NOTA: (Importante) L'efficienza di trasfezione dovrebbe raggiungere il 90% per produrre un virus ad alto titolo.
   7. Aggiungere 18 mL di DMEM con il 10% di FBS preriscaldato alle cellule Bosc23 e coltivare per 24 h.
   8. Ripetere il passaggio 1.6.
      NOTA: I supernatanti retrovirali dei passaggi 1.6 e 1.8 possono essere combinati una volta raggiunta la stessa temperatura (4 °C) per preservare l'integrità virale.
   9. Per evitare contaminazione da Bosc23 nei supernatanti virali, centrifugare il virus raccolto a 1500 × g per 10 min a 4 °C. Aliquotare il virus, congelare rapidamente utilizzando anidride carbonica solida o azoto liquido e conservare a -80 °C. Tuttavia, si noti che il virus appena preparato è di qualità superiore in termini di efficienza di infezione rispetto alle scorte congelate.
      NOTA: (Importante) Evitare cicli ripetuti di congelamento/scongelamento del virus, poiché portano alla degradazione virale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Mezzo con ridotto contenuto di siero	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutammina, Rosso fenolo
Siero bovino fetale (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Utilizzato per la coltura delle cellule HEK293T, NIH3T3, BOSC23
Penicillina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomicina solfato in polvere
Gentamicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polietilenimina	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Lineare, PM 25.000 (PEI 25000)