Generazione del virus respiratorio sinciziale ricombinante marcato con GFP mediante un sistema di espressione T7

Abstract

Fonte: Bouillier, C. et. al., Amplificazione e Titolazione di Virus Respiratorio Sinciziale Ricombinanti. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video illustra la generazione di un virus respiratorio sinciziale ricombinante che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) mediante un sistema di genetica inversa basato su T7. La co-trasfezione di plasmidi che codificano per proteine virali e per un genoma marcato con GFP porta all'espressione delle proteine e avvia il recupero del virus.

Protocollo

1. Recupero e Primo Passaggio del Virus Ricombinante

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi in un ambiente sterile, utilizzando un armadio di sicurezza di classe II.

1. Il giorno prima della trasfezione, preparare una sospensione della linea cellulare BSRT7/5 a 5 x 10⁵ cellule/mL in mezzo completo. Distribuire 2 mL di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Preparare un pozzetto per ciascun virus da recuperare e un ulteriore pozzetto come controllo negativo. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO₂. Verificare che le cellule raggiungano una confluenza dell’80%–90% il giorno successivo.
2. Scongelare i vettori del virus respiratorio sinciziale (RSV) di genetica inversa p-RSV-GFP e p-RSV-M2-1-GFP, nonché p-N, p-P, p-L e p-M2-1. Per ciascun virus da recuperare, mescolare in un tubo 1 µg di p-N e p-P, 0,5 µg di p-L, 0,25 µg di p-M2-1 e 1,25 µg di p-RSV (GFP o M2-1 GFP).
   NOTA: Possono essere utilizzati diversi vettori di espressione per le proteine virali del complesso della polimerasi (N, P, L e M2-1); tuttavia, il rapporto tra le proteine deve essere mantenuto. Eseguire il controllo negativo sostituendo il vettore p-RSV con un vettore vuoto.
3. Procedere con la trasfezione (vedere Tabella dei Materiali).
   1. Aggiungere 250 µL di mezzo con siero ridotto ai vettori mescolati. In un altro tubo, diluire 10 µL del reagente di trasfezione in 250 µL di mezzo con siero ridotto. Vortexare delicatamente entrambi i tubi e attendere 5 minuti. Mescolare il contenuto dei due tubi e attendere 20 minuti a temperatura ambiente.
   2. Risciacquare le cellule BSRT7/5 con 1 mL di mezzo con siero ridotto e distribuire 1,5 mL di mezzo essenziale minimo (MEM) con 10% di siero fetale bovino (FCS) senza antibiotici per pozzetto. Se necessario, incubare a 37 °C e 5% CO₂ fino al completamento dell'incubazione descritta al punto 1.3.1.
   3. Aggiungere 500 µL della miscela di trasfezione preparata al punto 1.3.1 a un pozzetto al termine dei 20 minuti di incubazione. Posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO₂ per 3 giorni. Non cambiare il mezzo di coltura delle cellule durante la trasfezione.
4. Osservare la fluorescenza della proteina verde fluorescente (GFP) (eccitazione a 488 nm ed emissione a 515–535 nm) al microscopio a fluorescenza invertito con un ingrandimento di 20x una volta al giorno per monitorare l'efficienza di recupero, utilizzando il filtro GFP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BSRT7/5		non disponibile in commercio	Vedi riferimento 22. Buchholz et al. 1999
Microscopio a fluorescenza per osservazioni	Olympus	IX73 Olympus microscope
Microscopio a fluorescenza per videomicroscopia	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5%	Sigma	H3375
L-Glutammina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Reagente Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Il protocollo al passaggio 2.3. è ottimizzato per questo reagente.
MEM (10x), senza glutammina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, integratore GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Reagente MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5%	Sigma	M7506
Mezzo con siero ridotto Opti-MEM I	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plasmidi		non disponibili in commercio	Vedi riferimento 21. Rameix-Welti et al. 2014