Saggio di titolazione a placche per la quantificazione del virus respiratorio sinciziale infettivo

Abstract

Fonte: Bouillier, C., et al. Generazione, amplificazione e titolazione di virus respiratorio sinciziale ricombinanti. J. Vis. Exp. (2019)

Il video illustra un saggio di titolazione in piastra utilizzato per quantificare il virus respiratorio sinciziale ricombinante infettivo (RSV) in monoculti di cellule epiteliali. Vengono mostrate l'infezione delle cellule ospiti con sospensioni virali diluite in serie, la limitazione della diffusione virale mediante un rivestimento semisolido a base di cellulosa e la formazione di placche localizzate derivanti dagli effetti citopatici. La procedura si conclude con la colorazione, la decontaminazione e il conteggio delle placche per determinare il titolo virale e valutare l'infettività dell'RSV.

Protocollo

1. Saggio di titolazione delle placche

1. Preparare le piastre a 12 pozzetti per la titolazione il giorno precedente l'esecuzione del saggio di titolazione (saranno necessari sei pozzetti per titolare un tubo di virus). Seminare i pozzetti con 1 mL di cellule epiteliali umane di tipo 2 (HEp-2) a 5 × 10⁵ cellule/mL in mezzo completo.
2. Il giorno successivo, preparare una sospensione sterile di cellulosa microcristallina (2,4% [p/v] in acqua) (vedere la Tabella dei Materiali).
   1. Disperdere 2,4 g di polvere di cellulosa microcristallina in 100 mL di acqua distillata, utilizzando un agitatore magnetico standard, fino a completa dissoluzione della polvere (di solito 4–12 h). Autoclavare la sospensione a 121 °C per 20 min e conservarlo a temperatura ambiente prima dell'uso.
      NOTA: In tali condizioni, la sospensione è stabile per 1 anno.
   2. Dopo aver aperto la soluzione in un ambiente sterile, conservarla a 4 °C per 6 mesi. Mescolare sempre la sospensione prima dell'uso (agitando a mano o con vortice) per assicurare un'omogeneità.
3. Preparare il 2× mezzo essenziale minimo (MEM) in un ambiente sterile. Diluire il MEM commerciale 10× con acqua sterile e aggiungere L-glutammina, 1.000 unità/mL di penicillina e 1 mg/mL di streptomicina. Agitare energicamente la diluizione e conservarla a 4 °C.
   NOTA: Eseguire i passaggi 1.4–1.10 in un ambiente sterile utilizzando una cappa di sicurezza di classe II.
4. Preparare sei provette contenenti 900 µL di MEM senza siero fetale bovino (FCS) per ogni virus da titolare (le provette di titolazione). Scongelare gli aliquote virali, vortexarle vigorosamente per 5 s e trasferirle 100 µL al primo tubo di titolazione.
5. Eseguire un’aliquota di diluizione decimale 6×, come segue. Aggiungere 100 μL di virus a 900 μL di mezzo nel primo tubo, chiudere il tubo con il tappo e mescolare il contenuto mediante vortex per alcuni secondi. Cambiare la punta sulla pipetta, aggiungere 100 µL del primo diluizione a 900 µL del mezzo nel secondo tubo, chiudere il tubo con il tappo e vortexare. Ripetere la procedura fino al sesto tubo.
   NOTA: È molto importante cambiare la punta per ogni diluizione.
6. Scrivere il nome del virus e i fattori di diluizione sulle piastre da 12 pozzetti HEp-2. Aggiungere un segno per abbinare ogni piastra al proprio coperchio, poiché potrebbero essere separati durante la colorazione (passaggio 1.9). Rimuovere il mezzo dalle piastre e distribuire 400 µL di un'opportuna diluizione per pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 2 h, per l'adsorbimento del virus.
   NOTA: Cambiare la punta della pipetta tra ciascun inoculo oppure procedere da concentrazione più bassa a più alta utilizzando la stessa punta. Inoculare un numero limitato di piastre (da 1 a 2) contemporaneamente per evitare che le cellule si secchino.
7. Preparare il sovrasotto in cellulosa microcristallina durante l'adsorbimento del virus (preparazione extemporanea). Per ottenere 100 mL di sovrasotto, mescolare 10 mL di sospensione di cellulosa microcristallina al 2,4%, 10 mL di 2× MEM, e 80 mL di MEM con 2% di FCS.
   1. Regolare il pH del 2× Regolare il MEM a circa 7,2 con una soluzione sterile di bicarbonato di sodio al 7,5%, in base all'indicatore cromatico. Aggiungere la sospensione di cellulosa microcristallina e il MEM e mescolare vigorosamente.
8. Al termine dell'incubazione di 2 h, aggiungere da 2 a 3 mL di strato di copertura in ogni pozzetto delle piastre a 12 pozzetti senza rimuovere l'inoculo. Prestare attenzione ad evitare la contaminazione dei pozzetti adiacenti con inoculi ad alto titolo virale. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO₂₂ per 6 giorni. Non spostare la piastra e non spostare l'incubatore durante l'incubazione.
9. Procedere alla colorazione delle cellule utilizzando una soluzione di violetto di metile (8% violetto di metile [v/v], 2% formaldeide [v/v] e 20% etanolo [v/v] in acqua).
   1. Proteggere la superficie di lavoro della cappa a sicurezza biologica con un foglio (il violetto di cristallo colora fortemente le superfici).
   2. Agitare delicatamente le piastre per rimuovere l'overlay di cellulosa microcristallina. Rimuovere i supernatanti e lavare le cellule 2 volte× con 1× soluzione salina fosfato (PBS). Manipolare le piastre una alla volta per evitare che le cellule si secchino. Aggiungere 1–2 mL di soluzione di violetto cristallo e attendere 10–15 minuti. Rimuovere la soluzione, che può essere riutilizzata per la colorazione di piastre successive.
   3. Immergere le piastre e i coperchi in una soluzione di candeggina fresca per alcuni secondi e, successivamente, lavarli accuratamente con acqua corrente. Si noti che le piastre e i coperchi vengono decontaminati mediante la candeggina.
   4. Posizionare le piastre e i coperchi su tovaglioli di carta e lasciarli asciugare. Asciugare le piastre a temperatura ambiente dopo il risciacquo con acqua e conservarle a temperatura ambiente. Per periodi di conservazione prolungati (mesi), proteggere le piastre dalla luce per preservare il colore. Si noti che, se le cellule perdono la colorazione, possono essere nuovamente colorate con violetto di cristallo.
10. Calcolare i titoli virali. Contare le placche nelle pozzette delle piastre asciutte, visibili ad occhio nudo. Verificare che il numero di placche delle diverse diluizioni sia coerente (fattore 10 tra ciascuna diluizione). Selezionare la pozzetta su cui le placche sono più facili da contare. Determinare il numero di placche in relazione al volume dell'inoculo e alla diluizione.
    NOTA: Nell'esempio fornito in Figura 1, vengono contate 21 placche al 10^-5 diluizione. Questi valori corrispondono a un titolo di

Risultati

Figura 1: Determinazione del titolo di RSV mediante saggio di formazione di placche. (A) Risultati del saggio di titolazione delle placche in una piastra a 12 pozzetti. Sono mostrati i sei pozzetti infettati con diluizioni seriali di un ceppo virale. Le diluizioni sono indicate in logaritmo in base 10. Tutte le cellule infettate con le prime tre diluizioni sono staccate. Il numero di placche osservato con le diluizioni 10^-4, 10^-5 e 10^-6 è consistente. (B) Illustrazione del conteggio delle placche (numeri gialli). La stella verde indica graffi sullo strato cellulare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di violetto cristallino	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), senza glutammina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, integrato con GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122