Valutazione della capacità di replicazione virale mediante saggio della trascrittasi inversa radiomarcato

Abstract

Fonte: Claiborne, D. T. et al. Un Metodo di Clonaggio Basato su Enzimi di Restrizione per Valutare la Capacità di Replicazione in vitro di Virus Chimera HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video illustra la valutazione della capacità replicativa virale mediante un saggio di trascrittasi inversa marcata radioattivamente. I supernatanti di coltura contenenti virioni progenie vengono aggiunti a una miscela di trascrizione inversa contenente un nucleotide marcato radioattivamente. Il segnale incorporato riflette il rendimento virale e l'efficienza di replicazione. L'immagine con fosforimager viene utilizzata per rilevare e confrontare i segnali tra i campioni in esame e quelli di tipo selvaggio.

Protocollo

1. Analisi della trascrittasi inversa (RT) nei supernatanti di colture cellulari

1. Impostare una cappa di sicurezza biologica in un impianto di livello di sicurezza biologica 3 (BSL-3) per l'uso con materiali radioattivi.
   1. Posizionare carta assorbente nella cappa e sostituire l'aspiratore con uno designato per uso radioattivo. 
      NOTA: Tutti i rifiuti radioattivi devono essere smaltiti correttamente in conformità con le normative di sicurezza.
2. Aggiungere 1-2 µl di [α-³³P] deossitimidina trifosfato (dTTP) a 10 mCi/ml e 4 µl di ditiotreitolo (DTT) 1 M a ciascun aliquota da 1 ml del mix master RT (vedere Tabella 1).
3. Mescolare attentamente ogni tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente il mix master RT, DTT e [α-³³P] dTTP con una pipetta da 1.000 µl e trasferire in un contenitore sterile.
4. Distribuire 25 µl del mix RT marcato in ciascun pozzetto di una piastra per reazione a catena della polimerasi (PCR) a 96 pozzetti con pareti sottili. 
   NOTA: Prevedere spazio per un controllo positivo (infezione con MJ4 wild-type (WT)) e un controllo negativo (infezione fittizia).
5. Aggiungere 5 µl di ciascun sopranatante alla piastra PCR contenente il mix master RT.
6. Chiudere ermeticamente la piastra PCR con un foglio adesivo e incubare per 2 ore a 37 °C in un termociclatore. Per motivi di sicurezza, risciacquare le punte della pipetta con Amphyl e smaltirle in un piccolo contenitore contenente rifiuti di Amphyl, che verranno successivamente smaltiti come rifiuti radioattivi.
7. Dopo l'incubazione, praticare piccoli fori nel foglio protettivo usando una pipetta multicanale da 200 µl. 
   NOTA: Se le punte della pipetta toccano il liquido nel pozzetto, sostituire le punte prima di passare alla colonna o alla riga successiva.
8. Mescolare i campioni 5 volte e trasferire 5 µl di ciascun campione sulla carta DE-81. Lasciare asciugare all'aria per 10 minuti.
9. Lavare le membrane 5 volte con soluzione salina-citrato di sodio 1x (SSC), quindi 2 volte con etanolo al 90% per 5 minuti per ogni lavaggio. Lasciare asciugare all'aria.
   1. Posizionare ciascuna membrana in un contenitore separato per il lavaggio, ad esempio una scatola per conservare panini, aggiungere abbastanza tampone di lavaggio (SSC 1x o etanolo al 90% (EtOH)) da coprire la membrana e agitare per 5 minuti.
   2. Versare il tampone di lavaggio in un contenitore separato e ripetere l'operazione. NOTA: I primi 3 lavaggi sono considerati radioattivi e devono essere smaltiti correttamente. Gli ultimi 2 lavaggi possono essere smaltiti normalmente.
10. Una volta asciutte, avvolgere con cura ciascuna membrana nella pellicola trasparente e esporla a uno schermo fosforescente in un cassetto ermeticamente chiuso per tutta la notte a temperatura ambiente.
11. Analizzare gli schermi fosforescenti con un fosforimager e quantificare i trascritti radioattivi.
12. Disegnare un cerchio intorno a ciascun segnale radioattivo utilizzando il software OptiQuant. Riportare in grafico i valori delle unità di luce digitale (DLU) per generare le curve di replicazione.
13. Per generare i punteggi di capacità replicativa, i valori DLU sono stati trasformati in log₁₀ e le pendenze sono state calcolate utilizzando i punti temporali dei giorni 2, 4 e 6. Le pendenze di replicazione sono state quindi divise per la pendenza del MJ4 WT per ottenere i punteggi di capacità replicativa. È importante normalizzare in base ai valori del MJ4 WT ottenuti dalla stessa piastra RT per ridurre la variabilità intra-saggio.

Tabella 1: Ricetta per il mix master per saggio di transcriptasi inversa marcata con radioisotopi.
NOTA: Conservare in aliquote da 1 ml a -20 °C.

Reagente	Volume (ml)
Acqua priva di nucleasi H2O	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Cloruro di potassio (1 M)	37.5
Cloruro di magnesio (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
Acido poliadenilico, sale di potassio (2 mg/ml)	1.25
Primer Oligo-dT (25 μg/ml)	3.25
Volume totale	500

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti per colture cellulari
Disinfettante/detergente Amphyl	Fisher	22-030-394
Vaschette serbatoio per multicanale, 55 ml	Fisher	13-681-501
Soluzione di cloruro di magnesio 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reagenti per saggio di quantificazione della trascrittasi inversa
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl 1 M, pH 8,0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Deve essere aggiustato a pH 7,8 con KOH
Cloruro di potassio (KCl) 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Aggiustare a soluzione 1 M
EDTA 0,5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Poliadenilico acido (Poly rA), sale di potassio	Midland Reagent Co.	P-3001
Primer oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
Schermo fosforico SR, ad alta risoluzione, piccolo	Perkin-Elmer	7001485
Piastra Corning Costar Thermowell 96 pozzetti modello (M) in policarbonato	Fisher	07-200-245	Prodotta da Corning Life
Nastro sigillante in alluminio per micropiastre Corning 96 pozzetti, non sterile	Fisher	07-200-684	Prodotta da Corning Life
Carta per scambio anionico DE-81	Whatman	3658-915
Citrato di sodio diidrato	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Cloruro di sodio	Fisher	S671-3
Cassetta per autoradiografia	Fisher	FB-CA-810
Schermo fosforico per stoccaggio Cyclone	Packard
Termociclatore, PTC-200	MJ Research