Preparazione dei campioni per la quantificazione virale basata sulla luciferasi

Abstract

Fonte: Garcia, V., et al. Titolazione ad alto rendimento di virus ricombinanti esprimenti luciferasi. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Questo video illustra la preparazione di campioni di colture cellulari per valutare il carico virale mediante un saggio basato sulla luciferasi. Vengono descritti i passaggi per infettare cellule epiteliali con un virus geneticamente modificato, trasferire i sopranatanti virali e gli standard nelle pozzette del saggio e favorire l'ingresso del virus mediante centrifugazione e incubazione. L'espressione della luciferasi funge da reporter, consentendo la quantificazione della concentrazione virale in base al segnale luminoso prodotto.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Ottenere campioni contenenti virus esprimenti luciferasi (qui VSV∆51-Fluc come esempio) per la titolazione e trasferirli in piastre a 96 pozzetti. In alternativa, eseguire le infezioni in piastre da coltura tissutale a 96 pozzetti e utilizzare direttamente i soprannatanti.
2. Lasciare due colonne non trattate per l'inclusione delle curve standard. Per esperimenti eseguiti direttamente in piastre a 96 pozzetti, effettuare la titolazione alla fine dell'esperimento (40 ore post-infezione) oppure conservare a -80 °C e titolare in un momento successivo.

2. Preparazione delle cellule permissive per la titolazione del virus

1. 24 ore prima della titolazione, preparare una sospensione di cellule Vero a una concentrazione di 2,5 x 10⁵ cellule/ml in Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 30 mM di 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES) e 1% di penicillina/streptomicina. 
   NOTA: sebbene questo protocollo utilizzi cellule Vero, qualsiasi linea cellulare permissiva adatta all'infezione da virus della stomatite vescicolare (VSV) potrebbe essere utilizzata.
2. Sezionare 2,5 x 10⁴ cellule (100 μl) in piastre bianche solide a fondo piatto da 96 pozzetti utilizzando un distributore per micropiastre.
   1. Preparare 12 ml di sospensione cellulare per piastra, più 5 ml per l'innesto.
   2. Pulire la cassetta del distributore per micropiastre lavando i tubi con 50 ml di acqua sterile.
   3. Riempire i tubi del distributore per micropiastre con la sospensione cellulare e far passare 5 ml di sospensione cellulare attraverso di essi.
   4. Selezionare un programma che eroghi 100 μl in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti con pareti bianche. Erogare e ripetere secondo necessità per piastre aggiuntive. Inoltre, sezionare alcuni pozzetti in una piastra trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti se si utilizzano piastre con fondo opaco e pareti bianche per verificare lo stato di salute e la densità cellulare.
   5. Al termine, riportare le cellule nel contenitore originale. Pulire la cassetta facendo passare 50 ml di etanolo al 70%, seguiti da 50 ml di acqua sterile tiepida attraverso i tubi.
   6. Assicurarsi che la cassetta e i tubi siano adeguatamente puliti tra un utilizzo e l'altro.
3. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.

3. Preparazione della curva standard virale

1. Preparare una curva standard di VSV∆51-Fluc in DMEM senza siero in modo che la concentrazione finale di unità formanti placca (pfu) per ml dopo il trasferimento su cellule Vero sia la seguente: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml e 10¹ pfu/ml. Preparare 50 μl di ciascuna concentrazione per piastra di cellule Vero più un extra del 10%.
   NOTA: Il titolo del ceppo virale contenente la luciferasi dovrà essere valutato in modo classico al fine di generare una curva standard che permetta una quantificazione assoluta. In alternativa, è possibile ottenere una quantificazione relativa senza informazioni precise sul titolo, impostando arbitrariamente il titolo virale in base ai passaggi di diluizione. Ad esempio, la prima diluizione della curva standard può essere impostata a 10⁸ unità virali, la successiva diluizione 1/10 a 10⁷ e così via. In questo caso, i valori devono essere espressi come variazione di fold rispetto a un campione predeterminato, poiché la quantificazione assoluta non sarà accurata.

4. Trasferimento dei supernatanti campione su cellule permissive

1. Verificare le cellule Vero piastrate in una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente al microscopio ottico per confermare che i monociti siano confluenti almeno al 95%.
2. Trasferire 25 μl di surnatante campione sulle cellule Vero seminate in piastre con pareti bianche. Non trasferire i surnatanti nelle 2 colonne destinate alle curve standard. 
   NOTA: Questa operazione può essere eseguita simultaneamente per tutti i pozzetti di una singola piastra utilizzando un manipolatore liquido a 96 canali.
3. Utilizzando una pipetta multicanale a 8 o 12 canali, aggiungere 25 μl di ciascuna diluizione della curva standard preparata al Passaggio 3 sulle cellule Vero nelle 2 colonne designate.
4. Centrifugare le piastre per 5 min a 430 x g a temperatura ambiente (RT).
5. Incubare per 5 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM)	Corning	SH30243.01
Siero bovino fetale	NorthBio Inc.	NBSF-701
Soluzione salina tampone al fosfato	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Preparare una soluzione 1 mM, pH 7,3
Piastre micro a 96 pozzetti in polistirene trattato per colture cellulari, bianche, a fondo piatto e opaco	Corning	3917	Per un'elevata produttività, possono essere utilizzate anche piastre a 384 pozzetti
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Lettore di piastre a monocromatore
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Sistema manuale di pipettaggio a 96 canali
Punte per Liquidator96 LTS sterili con filtri	Mettler Toledo	LQR-200F	Sono adatte qualsiasi punta sterile con filtro compatibile con i pipettatori scelti
Microflo	BioTek	111-206-21	Utilizzato per seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluorimetro per piastre micro