Generazione di cellule staminali embrionali di topo infettate da lentivirus

Abstract

Fonte: Chiarella, A. M. et. al., Inibizione della Trascrizione Genica Reindirizzando il Macchinario Cellulare con Modificatori Epigenetici Chimici. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra la generazione di cellule staminali embrionali di topo geneticamente modificate mediante trasduzione lentivirale. Le particelle lentivirali consegnano un marcatore di resistenza agli antibiotici, consentendo l'integrazione genomica stabile e la selezione delle cellule trasdotte.

Protocollo

1. Infezione di cellule staminali embrionali di topo (mESC) con lentivirus

1. Coltivare cellule staminali embrionali di topo (mESC) a basso passaggio (inferiore al passaggio 35), adattate al saggio del cromatina in vivo (CiA), in mezzo basale DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ad alto contenuto di glucosio, integrato con siero bovino fetale (FBS) di qualità per cellule staminali embrionali al 20%, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES), aminoacidi non essenziali 1x (NEAA), Pen/Strep, 2-mercaptoetanolo e fattore inibitore della leucemia (LIF) in rapporto 1:500, in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂.
   NOTA: Il LIF viene ottenuto dal sopranatante di cellule Cos produttrici di Lif-1C-alpha (COS LIF), raccolto in lotti e congelato a -80 °C.
   1. Coltivare le cellule su piastre pre-incubate per 1 - 3 h con gelatina 0,1% in soluzione salina tamponata al fosfato 1x (PBS), e successivamente lavate con PBS 1x. Nutrire le cellule ogni giorno e suddividerle ogni 2 - 3 giorni, a seconda della loro densità.
      NOTA: Dal punto di vista morfologico, le colonie di cellule staminali embrionali (ES) devono essere piccole, rotonde e ben distinte l'una dall'altra.
2. Passaggiare le mESC in una piastra a 12 pozzetti (100.000 cellule/pozzetto) un giorno prima dell'infezione.
   1. Contare le cellule con un emocitometro. Per le cellule coltivate in formato da 10 cm, aspirare il vecchio mezzo, aggiungere 5 mL di PBS 1x, aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina 0,25%. Incubare le cellule in tripsina per 8 min a 37 °C, agitando e battendo delicatamente la piastra a metà dell'incubazione. L'obiettivo di questo passaggio è ottenere una sospensione di cellule singole.
3. 48 h dopo il cambio del mezzo delle cellule renali embrionali umane 293T (HEK) dalla piastra da 15 cm, rimuovere e trasferire il sopranatante in un tubo conico da 50 mL.
4. Centrifugare il sopranatante a 300 x g per 5 min per formare un pellet dei detriti cellulari.
5. Filtrare il sopranatante attraverso una membrana da 0,45 µm.
   NOTA: Assicurarsi di utilizzare membrane di acetato di cellulosa senza tensioattivi (SFCA), poiché alcuni altri materiali possono trattenere il virus e ridurre notevolmente i rendimenti.
6. Concentrare il virus mediante ultracentrifugazione, utilizzando una centrifuga con rotore SW32, e far girare a 20.000 giri/min (~72.000 x g) per 2,5 h a 4 °C.
7. Mentre il virus si concentra mediante ultracentrifugazione, trattare le mESC CiA nella piastra a 12 pozzetti con mezzo ES fresco contenente 5 µg/mL di polibrene.
8. Al termine della concentrazione del virus, aspirare con attenzione il sopranatante e sospendere il pellet virale in 100 µL di PBS 1x (evitare bolle eccessive).
9. Aggiungere il virus e il PBS 1x in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Vortexare/agitare il tubo a 300 x g (o all'impostazione più bassa) per sospendere completamente il virus. Centrifugare brevemente il tubo in una mini-centrifuga da banco per 5 - 10 s per rimuovere le bolle.
10. Aggiungere 30 µL di virus in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra e quindi centrifugarla a 1.000 x g per 20 min.
    NOTA: La quantità di virus aggiunta può essere variata in base al titolo virale, che è inversamente proporzionale alla dimensione del costrutto di trasferimento.
    1. In alternativa, congelare rapidamente il virus con azoto liquido e conservarlo a -80 °C. Tuttavia, il congelamento del virus ridurrà il titolo virale.
11. Riposizionare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e cambiare il mezzo la mattina seguente (~16 h dopo) con mezzo ES fresco.
12. Dopo 48 h di infezione, selezionare le cellule che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico appropriato (ad esempio, 1,5 µg/mL di puromicina, 10 µg/mL di blasticidina, ecc.). Cambiare il mezzo ogni giorno e lavare le cellule con PBS 1x se la maggior parte delle cellule è in sospensione/morta. Mantenere il mezzo di selezione sulle cellule per 72 - 96 h in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (per colture cellulari)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Lotti singoli testati per la qualità
Provette per centrifuga del virus	Beckman Coulter	344058
Membrana del filtro per virus	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
Tripsina 0,25 %	Gibco	25200-056	con EDTA
Tripsina 0,05 %	Gibco	25400-054	con EDTA
Puromicina	InvivoGen	ant-pr
Ultracentrifuga	Optima	XPN-80
Rotor centrifugo SW-32	Beckman Coulter	14U4354
Portaprovette centrifugo SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 cellule renali embrionali umane	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Dono gentile di G. Crabtree
Cellule Cos produttrici di Lif-1C-alpha	Dono gentile di J. Wysocka