Identificazione di cellule infettate da virus vaccinia ricombinanti mediante selezione metabolica e fluorescente

Abstract

Fonte: Marzook, N. B., et al., Metodologia per la Generazione Efficienti di Proteine del Virus Vaccinia Marcati con Fluorescenza. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video illustra la generazione di virus vaccinia ricombinanti mediante ricombinazione omologa mediata da plasmidi in cellule epiteliali infette. Marcatori fluorescenti e metabolici consentono la selezione e l'identificazione di virus che esprimono proteine marcate.

Protocollo

Generazione di virus ricombinanti

1. Come illustrato nella Figura 1, infettare un monostrato di cellule BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (una linea cellulare epiteliale renale di scimmia derivata da cellule CV-1)] con virus vaccinia in mezzo privo di siero a una Multiplicità di Infezione (MOI) > 1.
2. Un'ora dopo l'infezione, recuperare le cellule con mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) e trasfettare con una miscela di plasmide vettore per ricombinazione e reagente di trasfezione in un rapporto di 3:1 in mezzo privo di siero.
3. Dopo 24 ore, raschiare e recuperare le cellule in DMEM privo di siero fetale bovino (FBS) ed eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento per rompere le cellule e rilasciare le particelle virali.
4. Eseguire un saggio delle placche con un sovrastrato liquido di DMEM con 10% FBS e reagenti di selezione GPT (guanina fosforibosiltransferasi (da E. coli), acido micofenolico (25 µg/ml) e xantina (250 µg/ml) come segue:
   1. Sezionare una piastra a 6 pozzetti con un monostrato di cellule BS-C-1.
   2. Infettare monostrati cellulari al 100% confluenti con diluizioni seriali delle cellule sottoposte a congelamento-scongelamento contenenti particelle virali, per garantire un'adeguata separazione delle singole placche.
   3. Coprire con un sovrastrato liquido di DMEM contenente il 10% FBS e i reagenti di selezione GPT – acido micofenolico e xantina alle concentrazioni finali rispettivamente di 25 µg/ml e 250 µg/ml.
5. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il sovrastrato liquido e utilizzare un microscopio a fluorescenza per individuare placche che mostrano una fluorescenza rossa diffusa corrispondente all'incorporazione di mCherry dal vettore TDS (selezione transitoria dominante) nel virus. A seconda del gene bersaglio e del marcatore fluorescente scelto, può essere osservata anche una fluorescenza localizzata del gene marcato all'interno della stessa placca rossa.
6. Prelevare più placche per ciascun virus ricombinante mediante raschiatura localizzata con la punta di una pipetta e 100 µl di DMEM contenente il 5% FBS per trasferire le cellule in una provetta Eppendorf, seguita da tre cicli di congelamento-scongelamento delle cellule raschiate per rilasciare i virus ricombinanti.
7. Aggiungere il DMEM contenente il virus sottoposto a congelamento-scongelamento a un monostrato di cellule in una piastra a 12 pozzetti per amplificare i virus ricombinanti con i reagenti di selezione GPT nel mezzo di crescita. Raschiare le amplificazioni riuscite 24 ore dopo l'infezione.
8. Eseguire un saggio delle placche delle placche amplificate con successo che mostrano fluorescenza rossa, questa volta con un sovrastrato di agarosio e selezione GPT, come segue:
   1. Sezionare una piastra a 6 pozzetti con un monostrato di cellule BS-C-1.
   2. Eseguire una diluizione seriale dei virus ricombinanti e infettare i pozzetti con diluizioni crescenti di virus in DMEM privo di FBS.
   3. Un'ora dopo l'infezione, rimuovere il mezzo liquido e sovrastratificare ogni pozzetto con agarosio allo 0,5% in mezzo essenziale minimo (MEM) contenente il 2,5% FBS, 292 µg/ml di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina, insieme ai reagenti di selezione GPT.
9. Due-tre giorni dopo l'infezione, selezionare le placche che mostrano una fluorescenza sia rossa sia del colore del marcatore fluorescente scelto, per amplificarle nuovamente, questa volta senza selezione GPT.
10. Eseguire il successivo saggio delle placche con un sovrastrato di agarosio senza selezione.
11. Prelevare le placche che hanno perso la fluorescenza rossa diffusa ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al marcatore scelto.
12. Continuare la purificazione delle placche senza selezione per ottenere una linea pura di virus ricombinanti che abbiano perso i geni di selezione mCherry e gpt ma mantengano la fluorescenza localizzata corrispondente al marcatore scelto. Verificare che le linee siano pure mediante saggio delle placche; tutte le placche dovrebbero presentare un fenotipo simile.

Risultati

Figura 1. Schema della procedura sperimentale per la creazione di un virus vaccinia ricombinante. Sono rappresentati gli eventi che si verificano a livello genetico e cellulare, insieme a immagini rappresentative di placche che illustrano i passaggi successivi alla creazione di un virus vaccinia fluorescente marcato con A3-GFP. (A) Le cellule infettate con il virus vaccinia vengono trasfettate con il vettore di ricombinazione TDS. (B) In questa figura è rappresentato solo il risultato della ricombinazione a sinistra, e come esempio viene utilizzato GFP come marcatore fluorescente di scelta. La ricombinazione a destra porterebbe all'incorporazione dell'intero plasmide TDS nel genoma in modo analogo, tranne per il fatto che il marcatore sarebbe fuso all'intero gene bersaglio nel passaggio intermedio, i.e., passaggio C. Viene eseguito un saggio delle placche su un monostrato cellulare con la miscela di ricombinazione e sottoposto a selezione GPT. (C) Vengono selezionate e amplificate le placche che mostrano sia fluorescenza rossa che verde, corrispondenti rispettivamente all'espressione di mCherry e GFP. Una volta rimossa la selezione, si avrà la perdita della fluorescenza rossa corrispondente alla perdita dei geni gpt e mCherry (D), e vengono selezionate e amplificate le placche che mostrano esclusivamente fluorescenza verde (E).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido micofenolico	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Sciogliere in NaOH 0,1 N
Xantina	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Sciogliere in NaOH 0,1 N
Reagente per trasfezione FuGENE HD	Promega	E2311
Microscopio a fluorescenza dotato di filtri Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)