Trasduzione adenovirale combinata e knockdown mediato da siRNA in cellule tumorali

Abstract

Fonte: Fuchs, M. et al. Adenofezione: Un metodo per lo studio del ruolo delle chaperonine molecolari nella morfodinamica cellulare mediante esperimenti di deplezione e recupero funzionale. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra il trasferimento mediato da adenovirus di un transgene fluorescente combinato con la trasfezione con fosfato di calcio-siRNA in cellule di cancro alla cervice. L'adenovirus esprime una proteina di sostituzione fluorescente, mentre l'siRNA induce la degradazione mirata dell'mRNA attraverso il legame con RISC. Questa co-trasfezione sequenziale permette l'abbattimento simultaneo della proteina endogena e il recupero funzionale mediato dal transgene, consentendo la visualizzazione e la conferma della sostituzione proteica mediante imaging a fluorescenza.

Protocollo

1. Trasduzione con adenovirus e silenziamento della proteina endogena mediante transfezione di RNA interferente a interferenza ridotta (siRNA) in cellule HeLa-RFP-H2B utilizzando precipitati di fosfato di calcio (CaPi)

NOTA: Un adenovirus di controllo che trasporta un gene non correlato (ovvero, LacZ) o nessun gene viene utilizzato per raggiungere una multiplicità di infezione minima (MOI) in tutte le adenofezioni (10-20 unità formanti placche (PFU)/cellula) impiegando la quantità minore di adenovirus ricombinante che trasporta il gene di interesse.

NOTA: È stato dimostrato che questa procedura aiuta a normalizzare l'espressione per cellula in una grande popolazione cellulare.

1. Un giorno dopo la semina delle cellule, contare il numero di cellule dalla piastra aggiuntiva. Aspirare il mezzo e risciacquare una volta con 1 mL di tripsina 0,05% / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Aggiungere nuovamente 1 mL di tripsina 0,05% / EDTA e incubare a 37 °C, 5% CO₂₂ finché tutte le cellule non si sono staccate. Separare bene le cellule utilizzando una pipetta da 1 mL e contare il numero di cellule per mL mediante emocitometro.
2. Determinare la quantità di virus necessaria per trasdurre le cellule a un MOI di 2 PFU della proteina di interesse (POI) per cellula e 18 PFU per cellula di un vettore vuoto (ad esempio, LacZ), per un totale di 20 PFU per cellula. Allo stesso tempo, trasdurre 4 PFU di ciascun baculovirus che codifica per l'actina marcata con proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina fluorescente rossa (RFP) marcata α-tubulina. Trasduci le cellule utilizzando il seguente protocollo di adenofezione.
3. Preparare in una cappa sterile un tubo di plastica da 1,5 mL per ogni condizione e aggiungere 400 μL di mezzo minimo essenziale alfa caldo (αMEM
4. Scongelare un'aliquote dei virus lentamente sul ghiaccio e, se necessario, diluire la soluzione virale in modo da poter pipettare un volume superiore a 1 μL per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio.
5. Aggiungere la quantità calcolata di virus per ogni condizione a ciascun tubo di plastica da 1,5 mL contenente 400 μL αMEM e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Riporre immediatamente la scorta del virus a -80 °C per mantenere la sua attività.
6. Aspirare il mezzo dalle cellule e pipettare delicatamente la miscela virale goccia a goccia. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂₂ e agitare delicatamente le piastre sotto la cappa sterile ogni 15 min per 1 h per assicurare che le cellule siano completamente ricoperte dal virus. L'uso di una piccola quantità di mezzo favorisce il contatto tra il virus e le cellule.
7. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 mL αMEM a ogni piastra per ottenere un volume totale di 2 mL, iniziare la sincronizzazione cellulare aggiungendo timidina 2 mM e incubare le cellule per ulteriori 2 ore a 37 °C, 5% CO₂₂.
8. Nel frattempo, preparare la miscela per la trasfezione con siRNA seguendo il metodo di trasfezione con fosfato di calcio (CaPi) (vedere Figura 1). Se non è necessario alcun siRNA, sostituire la quantità di siRNA con acqua sterile per eseguire una transfezione vuota.
9. Calcola 200 μL miscela per ogni condizione, ottenendo 400 μL per duplicato. L'esempio seguente si riferisce a una concentrazione finale di siRNA di 50 nM e deve essere adattato per ciascuna proteina di interesse. In un tubo di plastica da 1,5 mL, pipettare 50 μL 1 M CaCl₂₂ e 11 μL 20 μM siRNA in 139 μL H sterile₂O e mescolare mediante vortex. Dopo una breve centrifugazione, aggiungere con attenzione 200 μL 2× Salina tamponata con HEPES (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05) goccia a goccia.
   NOTA: Più piccole sono le gocce, più piccoli sono i precipitati, il che determina una maggiore efficienza di trasfezione. Mescolare delicatamente tre volte mediante iniezione d'aria utilizzando una 200 μL pipetta
10. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere lentamente 200 μL della miscela di trasfezione a ogni piastra e agitare trasversalmente. Trasferire le piastre a 37 °C, 5% CO₂₂ per 16 ore.
11. Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con 2 mL di HEPES tiepido (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) e aggiungere 2 mL αMEM. Non procedere con più di quattro piastre cellulari contemporaneamente, poiché le variazioni di temperatura influenzano la durata del ciclo cellulare.
12. Visualizzare l'efficienza di infezione al microscopio fluorescente invertito con un ingrandimento di 20-40x (aria) e acquisire tre immagini rappresentative per ogni condizione, sia nei canali fluorescenti che in trasmissione, per la documentazione. Sette ore dopo, aggiungere timidina 2 mM e incubare ulteriormente per 16 ore a 37 °C, 5% CO₂₂.
13. Il giorno seguente, 48 ore dopo la trasfezione con siRNA e l'infezione virale, risciacquare le cellule due volte con 2 mL di soluzione salina fosfato tamponata (PBS) tiepida e lasciare in incubazione per 7 ore in 2 mL αMEM senza Fenolo Rosso per l'immagineggiamento di cellule vive o con Fenolo Rosso per l'estrazione delle proteine.
14. Raccogliere le cellule per ogni condizione a 48 ore dal transfezionamento per la preparazione di estratti proteici e l'analisi mediante Western blot, al fine di determinare l'efficienza del silenziamento e l'espressione della proteina endogena.
    NOTA: Utilizzare anticorpi contro la proteina di interesse, nonché anticorpi appropriati come controlli di caricamento. L'efficienza dell'abbattimento deve essere determinata caricando quantità decrescenti di lisati cellulari di controllo (transfettati con siRNA di controllo) per ottenere una curva di titolazione (ad esempio, 1, ½, ¼, ⅛).

Risultati

Figura 1. Pianificazione di un protocollo tipico di adenofezione. Vengono mostrati i passaggi successivi di un esperimento tipico per il protocollo che utilizza precipitati di fosfato di calcio (sottolineati in grigio) o il protocollo che utilizza un reagente cationico per la trasfezione (evidenziato in giallo), inclusi il seeding cellulare, la trasduzione di adenovirus e baculovirus, la trasfezione di duplex di siRNA e la sincronizzazione cellulare mediante blocco doppio con timidina. Le linee temporali in ore per entrambi i protocolli sono mostrate sul lato destro della figura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
EDTA	Sigma	E5134
Serum bovino fetale (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectina	Sigma	F1141
Piastre con fondo in vetro, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Dono gentile del Dott. Sabine Elowe, Québec, Canada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutammina	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Mezzo Essenziale Minimo (MEM) Alfa	Wisent	310-101-CL
Mezzo Essenziale Minimo (MEM) Alfa senza Desossiribonucleosidi/Ribonucleosidi	Thermo Fisher	12000-022
Mezzo Essenziale Minimo (MEM) Alfa senza Fenolo Rosso	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Progettazione personalizzata di adenovirus	Welgen	Progettazione personalizzata
Cloruro di calcio	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actina-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulina-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Duplex di siRNA	Dharmacon	Progettazione personalizzata
Timidina	Sigma	T9250
Tripsina 2,5%	Thermo Fisher	15090-046