Marcatura dei residui di cisteina accessibili in superficie in particelle simil-virali ingegnerizzate

Abstract

Fonte: Natilla, A., e Hammond, R. W. Analisi della disponibilità al solvente dei residui di cisteina su particelle simili a virus del Maize rayado fino prodotte in piante di Nicotiana benthamiana e legame incrociato di peptidi alle particelle simili a virus. J. Vis. Exp. (2013)

Questo video dimostra l'etichettatura fluorescente specifica per sito di particelle simili a virus (VLPs) mutate prodotte in Nicotiana benthamiana mediante un colorante reattivo verso i tioli, seguita da purificazione ed elettroforesi su gel per confermare la modifica superficiale.

Protocollo

1. Inoculazione virale e purificazione di VLP da piante di Nicotiana benthamiana

1. Producete trascritti di RNA-T7 cappucciati da plasmidi vettoriali basati sul virus X della patata (PVX) che portano i geni della proteina capsidica (CP) selvatica (wt) e mutata in cisteina del virus del mal bianco del mais (MRFV), utilizzando il kit T7-mMessage mMachine di Ambion.
2. Per ogni reazione di trascrizione T7, inoculate due foglie completamente espanse di N. benthamiana con 10 μL di reazione e incubate le piante per 10 giorni in serra, al 60% di umidità, per 16 h con luce (25.000-30.000 lux) a 25 °C e 8 h al buio a 20 °C.
3. Raccoltate le foglie di N. benthamiana infette da virus a 10 giorni post-inoculazione (dpi), pesate il tessuto vegetale (50 grammi) e ponetelo sul ghiaccio.
4. Omogeneizzate il materiale vegetale in un frullatore in presenza di 100 mL di una soluzione fredda di tampone citrato di sodio 0,5 M, pH 5,5 (utilizzate 2 mL di tampone per grammo di tessuto vegetale).
5. Filtrate l'omogenato attraverso 3 strati di garza e chiarificate per centrifugazione a 27.000 × g per 30 min. Trasferite il soprannatante in un cilindro graduato refrigerato, misurate il volume, quindi trasferitelo in un becher sterile refrigerato. Scartate il pellet.
6. Trattate il soprannatante aggiungendo il 10% di polietilene glicole 8.000 (PEG 8.000), agitate per 15 min a 4 °C e incubate per ulteriori 45 min a 4 °C per precipitare la matrice di particelle simili a virus (VLPs)-PEG.
7. Centrifugate il campione a 27.000 × g per 20 min a 4 °C ed eliminate il soprannatante.
8. Trattate il pellet aggiungendo 8 mL di tampone citrato di sodio 0,05 M, pH 5,5, contenente il 2% di Triton X-100. Agitate bene i tubi da centrifuga per rilasciare il pellet. Trasferite il pellet e il tampone in un becher sterile refrigerato. Risciacquate immediatamente i tubi con 2 mL dello stesso tampone e aggiungete al becher. Agitate la sospensione a 4 °C fino a completa dissoluzione dei pellet (generalmente 1 h).
9. Chiarificate per centrifugazione per 5 min a 27.000 × g, scartate il pellet ed elaborate il soprannatante mediante centrifugazione a 140.000 × g per 2 h a 4 °C.
10. Risospendete il pellet in 1 mL di tampone citrato di sodio 0,05 M, pH 5,5 e ponete la sospensione in cima a un gradiente di saccarosio 10-40% preparato in tampone citrato di sodio 0,05 M, pH 5,5.
11. Centrifugate il gradiente per 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
12. Irradiate con luce la parte superiore del tubo da centrifuga e raccogliete la banda superiore diffusiva della luce a 4 cm dalla sommità del tubo, diluite con tampone citrato di sodio 0,05 M, pH 5,5, e centrifugate per 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
13. Risospandete il pellet in 0,5 mL di acqua sterile e conservate a 4 °C per un massimo di sei mesi.
14. Quantificate la concentrazione delle VLPs eseguendo un saggio proteico di Bradford. Il rendimento delle VLPs è compreso tra 1 e 3 μg/g di tessuto vegetale.

2. Reazioni di marcatura con fluoresceina-5-maleimide dei VLP

1. Preparare una soluzione 1 mM di fluoresceina-5-maleimide (427,37 g/mole) in tampone fosfato di sodio 50 mM, pH 7,0; 1 mM di acido etilendiamminotetracetico (EDTA). Mescolare utilizzando un vortex e verificare la completa dissoluzione. Proteggere il tubo dalla luce usando della carta d'alluminio.
2. Aggiungere la fluoresceina-5-maleimide ai VLP prodotti al passaggio 1 e mescolare. Utilizzare un eccesso molare 25 volte maggiore di fluoresceina-5-maleimide rispetto alla quantità molare di gruppi solfidrilici. In generale, l'uso di 30 μL di VLP alla concentrazione di 1 μg/μL e di 60 μL della soluzione di fluoresceina-5-maleimide produce risultati accettabili.
3. Incubare la reazione per 2 ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a 4 °C.
4. Terminare la reazione aggiungendo ditiotreitolo (DTT) fino a una concentrazione finale di 50 mM.
5. Rimuovere la fluoresceina non reagita utilizzando una colonna per desalting a rotazione (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) e centrifugando per 2 min a 1.500 × g a temperatura ambiente.
6. Per l'analisi mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE), aggiungere 10 μL di tampone campione 2 × Laemmli SDS-PAGE a 10 μL di ciascuna reazione. Conservare la proteina marcata al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di un mese oppure in aliquote monouso a -20 °C per un massimo di 3 mesi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi sottili e trasparenti	Beckman	344059
Kit mMESSAGE mMACHINE T7	Life Tecnologies	AM1344M
Fluoresceina-5-maleimide	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 non disponibile, sostituire con F150
Buffer di Laemmli	Bio-Rad	1610737
Buffer di corsa Tris-Glicina SDS (Dodecilsolfato di Sodio)	Invitrogen	LC2675
Buffer di trasferimento Tris-Glicina	Invitrogen	LC3675
Sandwich di carta filtro e membrana di nitrocellulosa	Invitrogen	LC2001
Maleimide-Polietilenglicole (PEG) 2-Biotina EZ-Link, formato senza pesatura	Thermo Scientific	21901