Infezione intranasale da Herpesvirus murino nel topo per la valutazione delle risposte immunitarie dell'ospite

Abstract

Fonte: Zhang, J., et al. P. Analisi della segnalazione immunitaria innata nell'evasione virale della produzione di citochine. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video dimostra la somministrazione intranasale di herpesvirus murino in topi per indurre una risposta immunitaria specifica per il polmone. Il tessuto polmonare viene successivamente processato per ottenere supernatanti contenenti citochine, da utilizzare per la valutazione successiva delle risposte immunitarie dell'ospite.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale per la cura degli animali in istituto e dal collegio veterinario di JoVE.

1. Secrezione di citochine mediante ELISA in topi infettati da γHV68

1. Anestetizzare topi C57BL/6 (B6) di sesso corrispondente, di età compresa tra 6 e 8 settimane (8-12 topi/gruppo), mediante iniezione intraperitoneale di 1,5 mg di ketamina/0,12 mg di xilazina, e inoculare per via intranasale 40 PFU (unità formanti placche) di γHV68 in 40 µl. In diversi momenti successivi all'infezione, sopprimere gli animali mediante inalazione di CO₂ seguita da dislocazione cervicale.
2. Aprire il torace con un'incisione laterale sinistra lungo lo sterno e tagliare le costole con forbici affilate. Raccogliere i tessuti polmonari.
3. Raccogliere metà del tessuto polmonare (lobo sinistro) in provette sterili da 1,5 ml con tappo a vite contenenti 500 µl di perle di Zirconia/Silice da 1,0 mm. Aggiungere 1 ml di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) freddo privo di siero nella provetta ed omogeneizzare il tessuto polmonare mediante bead-beating per 30 secondi. Raffreddare le provette sul ghiaccio per 2 minuti e ripetere il processo una volta.
4. Centrifugare le provette (15.000 x g per 10 minuti) a 4 °C, raccogliere il sopranatante e misurare la produzione di citochine come descritto di seguito.
5. Misurare le citochine utilizzando kit ELISA (saggio immunoenzimatico) per citochine disponibili in commercio, seguendo le istruzioni del produttore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit ELISA per CCL5 murino	R&D Systems	DY478
Perle di Zirconia/Silice da 1,0 mm	BioSpec Products	11079110z