Produzione di particelle simili a virus in E. coli ingegnerizzati

Abstract

Fonte: Chen, Z., et al. Produzione di particelle simili a virus PEGilate fluorescenti indotte da coniugazione mediante chimica dibromomaleimidica-disolfuro. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra il metodo per l'espressione controllata della proteina del capside del batteriofago Qβ in E. coli ingegnerizzati. Le proteine risultanti si assemblano autonomamente in particelle simili a virus, che vengono raccolte per la successiva bioconiugazione.

Protocollo

Espressione di Qβ

1. Pulire l'area del bancone con una soluzione 1:1 di candeggina/etanolo.
2. Preparare due colture iniziali da 3 mL in un ambiente asettico aggiungendo singole colonie di E. coli BL21(DE3) in 3 mL di terreno Super Optimal Broth (SOB) in un ambiente asettico.
3. Far crescere in agitazione a 250 rpm in una stanza a 37 °C e umidità relativa (rH) 0% per tutta la notte.
4. Innestare la coltura iniziale nel terreno SOB:
   1. Prelevare entrambe le colture iniziali da 3 mL dallo shaker e, in un ambiente asettico, versare ciascuna coltura iniziale in uno dei due becher Erlenmeyer baffati da 2 L contenenti 1 L di terreno SOB fresco ciascuno.
   2. Posizionare il terreno inoculato in agitazione a 250 rpm in una stanza a 37 °C e rH 0%.
5. Far crescere i batteri in agitazione a 250 rpm in una stanza a 37 °C e rH 0% fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,9–1,0.
6. Aggiungere 1 mL di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) 1 M utilizzando una pipetta P1000 per indurre l'espressione proteica.
7. Lasciare il terreno in agitazione a 250 rpm in una stanza a 37 °C e rH 0% per tutta la notte.
8. Il mattino seguente, rimuovere il terreno dallo shaker e centrifugarlo utilizzando bottiglie da 1000 mL a 20.621 × g per 1 h a 4 °C per raccogliere le cellule.
9. Eliminare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
   1. Versare il surnatante in un becher contenente circa 5 mL di candeggina per uccidere i batteri. Questo rappresenta un rifiuto.
   2. Utilizzare una spatola per raschiare il pellet cellulare dal fondo della bottiglia da centrifuga e trasferire il pellet in una provetta da centrifuga da 50 mL.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo LB (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Triptone, in polvere	Research Products International	T60060-1000.0
Estratto di lievito, in polvere	Research Products International	Y20020-1000.0
Solfato di magnesio anidro	P212121	CI-06808-1KG
Cloruro di sodio (cristallino/Certificato ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	BP366-500
Sistema di purificazione dell'acqua Elga PURELAB Flex 3	Fisher Scientific	4474524
Monoidrogenofosfato di potassio	Fisher Scientific	BP362-1
Fosfato bibasico di potassio anidro	Fisher Scientific	P288-500
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Beute per centrifuga Nalgene con tappo, in copolimero di polipropilene	Thermo Scientific	3141-0250
Agitatore orbitale VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetta P1000	Gilson	F123602
Tubo conico da centrifuga Falcon da 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22