Funzionalizzazione fluorescente di particelle simil-virali tramite ri-ponte dei disolfuri

Abstract

Fonte: Chen, Z., et al. Produzione di particelle tipo virus PEGilate fluorescenti indotte da coniugazione mediante chimica dibromomaleimide-disolfuro. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la funzionalizzazione fluorescente di particelle simili a virus mediante il ripristino di disolfuri ridotti con un legame di polietilenglicole (PEG), producendo coniugati stabili e tracciabili adatti all'imaging cellulare e al rilascio mirato in applicazioni biomediche.

Protocollo

1. Coniugazione di composti Dibromomaleimide (DB) su batteriofago Qβ

1. Ridurre i disolfuri su Qβ.
   1. Sciogliere 0,0020 g di tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) in 1 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre 100x.
      NOTA: Preparare il TCEP fresco prima della riduzione.
   2. Aggiungere 200 µL di Qβ (5 mg/mL) in una provetta da microcentrifuga.
   3. Successivamente, aggiungere 20 µL della soluzione madre di TCEP 100x.
   4. Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
2. Ri-formare i disolfuri ridotti utilizzando polietilenglicole dibromomaleimide (DB-PEG).
   1. Sciogliere 0,0017 g di dibromomaleimide-polietilenglicole (DB-PEG) in 100 µL di DMF.
   2. Aggiungere 680 µL di soluzione di fosfato di sodio 10 mM (pH 5).
   3. Aggiungere il Qβ ridotto alla soluzione di DB-PEG e osservare il processo di mescolamento sotto una lampada UV a 365 nm (ultravioletto). La fluorescenza giallo brillante può essere immediatamente visualizzata con una lampada UV portatile a 365 nm al momento del mescolamento.
   4. Lasciare procedere la reazione tutta la notte a temperatura ambiente (RT) su un agitatore rotante.
3. Purificare la miscela di reazione mediante filtro centrifugo (cut-off del peso molecolare (MWCO) = 10 kDa) tre volte utilizzando PBS 1x (soluzione salina tamponata al fosfato) a 3.283 x g per 20 min a 4 °C.
4. Monitorare la coniugazione mediante SDS-PAGE non riducente (elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio) ed elettroforesi su gel di agarosio nativo.
   NOTA: Le VLP (particelle simili a virus) migrano come particelle integre in gel di agarosio nativo e vengono separate in base alla loro carica, dimensione e forma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2,3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Glicole polietilenico	Alfa Aesar	41561-22
Fosfato di sodio	Fisher Scientific	AC424375000
Acrilamide/bis-acrilamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodio dodecilsolfato	Sigma Aldrich	L3771-100G
Persolfato di ammonio	Fisher Scientific	BP179-100
Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Provetta conica da 15 mL Falcon	Fisher Scientific	14-959-53A
Microprovette: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Agitatore orbitale VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetta P1000	Gilson	F123602
Pipetta P200	Gilson	F123601
Pipetta P100	Gilson	F123615
Pipetta P20	Gilson	F123600
Pipetta P10	Gilson	F144802
Bilancia da laboratorio classica ad alta precisione Intel Weighing PM-100	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100