Preparazione sicura di campioni virali per la microscopia elettronica a trasmissione

Abstract

Fonte: Blancett, C. D., et al. Utilizzo di Capsule per la Colorazione Negativa di Campioni Virali all'Interno di Strutture di Contenimento Biologico. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video illustra la preparazione sicura di campioni virali per la microscopia elettronica a trasmissione. Le particelle virali vengono fissate con glutaraldeide, colorate con un agente denso agli elettroni e sottoposte a fissazione mediante vapore di tetrossido di osmio per stabilizzare le strutture e garantire un'inattivazione completa, assicurando una manipolazione sicura dei campioni virali migliorando al contempo il contrasto per ottenere immagini TEM di alta qualità.

Protocollo

1. Il Metodo della Capsula per la Colorazione Negativa in Biocontenimento mediante Inattivazione con Glutaraldeide Acquosa e Vapore di Osmio Tetroxido al 1%

1. All'interno del cabinet di sicurezza biologica (BSC) con contenimento, aspirare 40 µL di sospensione virale nella capsula collegata a una pipetta.
   NOTA: La pipetta rimane collegata alla capsula fino al completamento del processo.
2. Posizionare la pipetta lateralmente per 10 minuti con le griglie orientate in orizzontale. Questo passaggio favorisce una distribuzione uniforme delle particelle virali sulle griglie rivestite.
3. Inattivare il virus all'interno della capsula all'interno del BSC con contenimento biologico.
   1. Prendere la pipetta e premere lo stantuffo per dispensare la soluzione virale in un contenitore per rifiuti.
   2. Aspirare 40 µL di fissativo al 2% di glutaraldeide nelle capsule.Attenzione: La glutaraldeide è una sostanza chimica pericolosa e richiede adeguate misure di protezione. Può essere utilizzata per brevi periodi in un BSC normale, ma per periodi prolungati con reagenti aperti è necessario operare in un BSC canalizzato o in una cappa chimica.
   3. Posizionare la pipetta lateralmente per 20 minuti. Questo passaggio garantisce un'adeguata fissazione dei campioni.
   4. Eliminare il fissativo e aspirare 40 µL di acqua deionizzata (DI) nelle capsule per rimuovere il fissativo. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 3 cicli di risciacquo.
4. Aspirare 40 µL di acetato di uranile (UA) al 1% o di acido fosfotungstico di potassio (PTA) al 1% nelle capsule e lasciare in posa per 30 s.
   NOTA: Il tempo di colorazione può variare da 10 s a 1 minuto a seconda del campione virale.
   ATTENZIONE:: L'UA è un emettitore alfa e una tossina cumulativa. Manipolarlo con adeguate misure di protezione.
5. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie tamponando con un pezzo di carta filtro sul bordo delle griglie, mantenendo le griglie all'interno della capsula.
6. Procedura di inattivazione mediante vapore di osmio tetrossido.
   1. Posizionare la capsula, con il coperchio aperto, in un tubo da centrifuga da 50 mL contenente carta filtro imbevuta di soluzione al 1% di osmio tetrossido.Attenzione: L'osmio tetrossido è estremamente tossico e ha una bassa pressione di vapore. Deve essere utilizzato in un BSC canalizzato o in una cappa chimica. Manipolarlo con adeguate misure di protezione. Affiggere informazioni di avvertenza nell'area di lavoro.
   2. Chiudere ermeticamente il tubo da centrifuga da 50 mL per 1 ora per consentire la completa permeazione del vapore di osmio tetrossido. Successivamente, decontaminare e trasferire il tubo fuori dal contenimento biologico al laboratorio EM (microscopia elettronica) di livello BSL-2.
7. Rimuovere le griglie EM dalla capsula.
   1. Nel laboratorio EM di livello BSL-2, rimuovere la capsula dal tubo da centrifuga e posizionarla su una pipetta.
   2. Aspirare 40 µL di acqua DI nella capsula e dispensare l'acqua in un contenitore per rifiuti per tre volte.
   3. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie tamponando con carta filtro sul bordo delle griglie.
   4. Dopo l'essiccazione all'aria, conservare le griglie per successivi esami mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Griglie TEM rivestite in Formvar/carbonio	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
Capsule mPrep/g	EMS	85010-01	confezione
Copriflange mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
Glutaraldeide	EMS	16320	soluzione al 50%, grado EM
Osmio tetroxido	EMS	19190	soluzione acquosa al 4%
Acetato di uranile	EMS	22400	in polvere
Acido fosfotungstico di potassio	EMS	19500	in polvere
Carta da filtro	Whatman	1450-090	dimensione 50
Microscopio elettronico a trasmissione	JEOL	JEM-1011	TEM