Il video dimostra il rilevamento degli intermedi di RNA a doppio filamento del virus Zika in cellule epiteliali infette mediante immunocitochimica. Le cellule infette vengono fissate e quindi bloccate con una soluzione di blocco. Vengono aggiunti l'anticorpo primario e quello secondario. I nuclei vengono colorati con un colorante fluorescente. L'RNA a doppio filamento virale marcato viene quindi osservato al microscopio a fluorescenza.
Articolo metodologico
Rilevazione degli intermedi di replicazione del dsRNA del virus Zika tramite immunocitochimica
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Saggio di replicazione del genoma virale di Zika
- Sezionare cellule Vero naive a 1 x 105 cellule per pozzetto in volumi di 2 ml utilizzando una piastra a 12 pozzetti. Il giorno successivo, preparare inoculi virali (MOI, Multiplicity of Infection, di 0,01 e 0,1; 400 µl/pozzetto) a titolo basso e alto utilizzando mezzo privo di siero in triplicato. Per l'infezione mock, utilizzare solo mezzo privo di siero (400 µl/pozzetto).
- Incubare la piastra inoculata a 37 °C con 5% di CO2 per 4-6 ore. Distribuire l'inoculo inclinando delicatamente la piastra lateralmente ogni ora.
- Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzo supplementato con siero (2 ml per pozzetto).
- Agli intervalli temporali di 48 e 96 ore, raccogliere i campioni per l'immunocitochimica (ICC).
- Eseguire l'ICC utilizzando le cellule fissate con metanolo.
- Lavare le cellule fissate tre volte con soluzione salina fosfato tampone 1x (PBS) e bloccare con il buffer di blocco per ICC (3% siero di capra, 3% albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Triton-x 100 in PBS).
- Utilizzare l'anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 (1 µg/ml) in una diluizione 1:100 nel buffer di blocco e incubare tutta la notte a 4 °C.
- Lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere un anticorpo secondario caprino anti-topo IgG-594 (1 µg/ml) in una diluizione 1:1.000 nel buffer di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS 1x e colorare i nuclei utilizzando il colorante Hoechst e osservare le cellule mediante microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 100X (Figura 1).
Risultati
Figura 1: Saggi per la valutazione della replicazione del virus Zika (ZIKV). (A) Il grafico mostra il contenuto genomico del virus Zika misurato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR). Sia i primer pan-genotipo (ZIKV GEN) che quelli specifici per la ceppa PRVABC59 (ZIKV UNI) hanno mostrato uguale sensibilità e specificità. Come previsto, i primer per il virus dell'epatite C (HCV) non hanno amplificato alcun prodotto. (B) Il grafico mostra la cinetica di crescita del virus Zika nei punti temporali indicati, in cellule infettate con titolo basso e alto, rispetto al controllo non infettato (mock). Sono riportati i valori medi e le deviazioni standard. (C) Saggio di immunocitochimica per lo studio della replicazione virale. Le cellule infettate dal virus Zika sono state specificamente marcate con anticorpi anti-dsRNA. A 48 hpi, le cellule infette sono presenti in pochi gruppi, mentre a 96 hpi la maggior parte delle cellule è infetta. La colorazione con Hoechst è stata utilizzata per la visualizzazione dei nuclei (barra della scala = 50 µm). BF: immagine in campo chiaro.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Secondario anticorpo caprino anti-topo IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| Linea cellulare Vero | ATCC | CCL-81 | |
| Stirpe virale di Zika PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse Ti con sorgente luminosa Nikon Intensilight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
