Concentrazione e purificazione delle particelle virali

Abstract

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e somministrazione di retrovirus e lentivirus CRISPR ad alto titolo mediante iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video illustra il processo passo dopo passo per la concentrazione e la purificazione di particelle lentivirali da una sospensione mista contenente detriti cellulari dell'ospite. La procedura utilizza centrifugazione, filtrazione e precipitazione con PEG-sale per isolare le particelle virali rimuovendo le impurità solubili. Il prodotto finale viene risospeso in un buffer e conservato a temperature ultra-basse per preservare l'infettività virale e l'integrità strutturale.

Protocollo

1. Concentrazione e Purificazione del Virus

1. Preparare una soluzione 5x di polietilene glicole 6000 aggiungendo il 40% di polietilene glicole 6000 e 1,5 M di NaCl all'acqua ddH₂O. Autoclavare la soluzione nel ciclo liquido per 45 min a 121 °C. Mescolare lentamente la soluzione durante il raffreddamento.
   NOTA: La soluzione inizialmente sarà torbida e poi diventerà limpida durante il raffreddamento.
2. Centrifugare il tubo conico da 50 ml contenente entrambe le raccolte di supernatante virale a 2.000 x g per 10 min per formare un pellet del materiale insolubile. Purificare il mezzo virale filtrandolo attraverso un filtro siringa a bassa adesione proteica da 0,45 µm (PES o PVDF).
3. Aggiungere la soluzione 5x di polietilene glicole 6000 al mezzo (la concentrazione finale dovrà essere dell'8% di polietilene glicole 6000 e 0,3 M di NaCl). Mescolare capovolgendo il tubo diverse volte (non vortexare). Incubare la soluzione contenente il polietilene glicole e il virus a 4 °C per 12 ore o più, mescolando occasionalmente.
4. (Giorno 9) Centrifugare la soluzione contenente il polietilene glicole e il virus a 2.500 x g per 45 min. Rimuovere e scartare il soprannatante e centrifugare nuovamente per 2 min. Rimuovere nuovamente e scartare il soprannatante.
5. Risospendere il pellet aggiungendo 320 µl di soluzione salina tamponata al fosfato sterile (i 320 µl corrispondono a 1/100 del volume originale del mezzo contenente il virus raccolto) e incubare tutta la notte a 4 °C. In alternativa, risospendere il pellet a temperatura ambiente su un agitatore per 30 min.
6. Dopo aver risospeso il pellet, aliquotare il virus (5-10 µl per tubo da 0,5 ml) e congelare le aliquote a -80 °C (i cicli di congelamento-scongelamento o il mantenimento a 4 °C ridurranno drasticamente il titolo).
7. Determinare il titolo dei virus utilizzando protocolli standard, ovvero eseguire una serie di diluizioni su una piastra a 6 pozzetti di cellule HEK293T e contare manualmente le colonie fluorescenti dopo 48 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Elenco di reagenti per la trasfezione
Provette in polistirene da 5 ml	Fisher Scientific	352054
polietilene glicole 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Soluzione salina fosfato tampone (PBS)	National Diagnostics	CL-253
Microprovette da 0,5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A