Valutazione di un sistema di overlay liquido per i saggi di placche virali

Abstract

Fonte: Baer, A. e Kehn-Hall, K. Determinazione della Concentrazione Virale Mediante Saggi di Placca: Utilizzo di Sistemi di Copertura Tradizionali e Innovativi. J. Vis. Exp. (2014).

In questo video viene dimostrato l'utilizzo di un rivestimento liquido a base di cellulosa microcristallina in un saggio basato su placche, confrontandone l'efficacia nella formazione di placche virali con quella di un rivestimento tradizionale in agarosio semisolido.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule e dei reagenti

1. Il giorno precedente al saggio, seminare le cellule ospiti appropriate per il virus in questione (Tabella 1 e Tabella 2) a confluenza del 90-100%.
2. Preparare una soluzione fissativa di formaldeide al 10% in H₂Ad esempio, mescolare 5,56 ml di formaldeide al 36% in soluzione madre con 14,44 ml di H₂O distillata₂O (dH₂O)₂O).
   NOTA: Adottare adeguate pratiche di manipolazione sicura e ventilazione quando si utilizza formaldeide.
3. Preparare la soluzione di violetto di cristallo: 1% di violetto di cristallo (CV) in etanolo al 20% e acqua deionizzata₂O.
4. Preparare il mezzo per placche 2x (dipendente dal tipo di cellula, a concentrazione 2x; vedere Tabella 2). Filtrare utilizzando un 0.2 µm filtrare se qualche reagente non è sterile
5. Preparazione di rivestimenti immobilizzantiTabella 3)
   1. Per gli strati liquidi, preparare una soluzione sterile al 2,4% di Avicel in acqua dH₂O. Per evitare aggregazioni, aggiungere la polvere a un matraccio contenente acqua in rapida agitazione con una barretta magnetica, versare lentamente l'Avicel e agitare vigorosamente a temperatura ambiente (RT). Quando la soluzione diventa troppo viscosa per essere omogeneizzata con la barretta magnetica, passare a un agitatore orbitale per matracci >30 min con agitazione vigorosa per garantire un'omogeneizzazione uniforme.
      NOTA: Soluzioni stock possono essere preparate a concentrazioni inferiori, ma potrebbero separarsi e dovranno essere nuovamente miscelate per garantire l'omogeneizzazione. Possono essere utilizzate soluzioni operative di Avicel comprese tra lo 0,6% e il 3%.
   2. Dopo l'omogeneizzazione, sterilizzare la soluzione in autoclave e conservarla sigillata a temperatura ambiente.
   3. Per gli strati di agarosio e di carbossimetilcellulosa (CMC), preparare una soluzione madre in dH₂O₂O di CMC al 2% o agarosio allo 0,6%. Mescolare con un agitatore magnetico e autoclavare o riscaldare a microonde per portare in soluzione.

2. Diluizioni e infezioni

1. Il giorno successivo alla semina, verificare visivamente la confluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il saggio. Assicurarsi che la morfologia cellulare sia standard e che sia presente un monostrato confluenziale al circa 90%.
2. Eseguire una diluizione seriale decimale dei campioni infettivi, utilizzando come diluente il mezzo di crescita cellulare impiegato per la propagazione virale (Tabella 2). Variare il numero di diluizioni in base al titolo atteso del virus in esame e utilizzare sempre un campione di controllo non infetto per garantire in modo indipendente la vitalità cellulare e facilitare l'identificazione delle placche.
3. Dalle diluizioni seriali, infettare le cellule per 45 minuti fino a 1 ora (Tabella 1). Utilizzare un volume sufficiente di inocolo per coprire le cellule, mantenendo nel contempo il volume il più basso possibile per massimizzare il contatto del virus con il monostrato (Tabella 4). Agitare delicatamente le piastre ogni 20 minuti per assicurare una distribuzione uniforme e prevenire l'essiccamento del monostrato cellulare.
4. Dopo l'infezione, aggiungere direttamente nel pozzetto un volume appropriato di mezzo immobilizzante sugli inocoli (Tabella 2), utilizzando una miscela 1:1 di mezzo per placche 2x e il mezzo immobilizzante scelto (CMC, agarosio o Avicel). Agitare delicatamente per mescolare.
   1. Per i rivestimenti liquidi, mescolare 1:1 con mezzo per placche 2x riscaldato e stock di Avicel al 1,2 - 2,4% a temperatura ambiente per ottenere una soluzione di lavoro con concentrazione di mezzo di rivestimento all'0,6-1,2% di Avicel.
   2. Per un rivestimento in agarosio, utilizzare una miscela 1:1 di mezzo per placche 2x riscaldato e una soluzione stock di agarosio al 0,6% riscaldato, quindi collocare in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti per equilibrare la temperatura, ottenendo una concentrazione finale di agarosio/ricoprimento dello 0,3%.
   3. Per il CMC, preparare una soluzione stock al 2% e trattarla come descritto per il rivestimento in agarosio.
   4. Quando si applica il rivestimento sul monostrato, equilibrare sempre l'agarosio caldo o il CMC in acqua a 56 °C per evitare danni al monostrato. Assicurarsi che la soluzione sia calda, ma non bollente al tatto, per prevenire la morte cellulare e una riduzione dei titoli virali. La maggior parte dei rivestimenti in agarosio inizia a solidificare sotto i 42 °C; lavorare rapidamente e/o preparare piccole quantità per evitare la solidificazione durante la manipolazione.
5. Dopo l'aggiunta del rivestimento, incubare le piastre per ottenere placche distinte chiaramente numerabili. La formazione delle placche può richiedere da 2 a 14 giorni, a seconda del virus analizzato (Tabella 1).
   NOTA: Una volta posizionate in incubatore, non spostare le piastre con rivestimento liquido. Il movimento dei rivestimenti liquidi durante l'incubazione provocherà placche sfocate. I rivestimenti in agarosio e CMC sono semisolidi e possono essere spostati o controllati periodicamente al microscopio ottico per monitorare lo sviluppo delle placche.

3. Fissazione e colorazione delle cellule

1. Per fissare le cellule, versare via o aspirare l'overlay di Avicel e fissare le cellule utilizzando la soluzione al 10% di formaldeide per 30 minuti fino a tutta la notte (<1 ml per pozzetto per una piastra a 6 pozzetti).
   1. Per l'agarosio o il CMC, aggiungere direttamente la soluzione di formaldeide sull'overlay per 1 ora fino a tutta la notte.
      NOTA: I campioni possono essere conservati per lunghi periodi nel fissativo, purché non evapori e non si secchi, poiché ciò potrebbe alterare il monolayer.
2. Prima della colorazione e dopo la fissazione, scartare la formaldeide e rimuovere i tappi semisolidi di agarosio e CMC con acqua corrente oppure manualmente con una spatola. Risciacquare le placche di Avicel con acqua per rimuovere l'overlay/fixativo residuo prima della colorazione.
3. Per la colorazione, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di violetto di cristallo per circa 15 minuti. Agitare delicatamente le piastre se necessario per garantire una copertura uniforme.
4. Rimuovere delicatamente il colorante violetto di cristallo con acqua. Una volta fissate, colorate e asciugate, le placche possono essere conservate indefinitamente per analisi future.

Tabella 1. Condizioni di inoculazione e tipi cellulari per il saggio delle placche

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo di cellula	Vero	Vero	MDCK
Periodo di infezione	1 hr	1 hr	45 min
Tempo di incubazione	3 giorni	2 giorni	3 giorni

 

Tabella 2. Terreni di coltura per placche e per la crescita virale/cellulare

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo di cellula	Vero	Vero	MDCK
Tipo di crescita	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Mezzo per formazione di placche	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Mezzo Dulbecco modificato di Eagle integrato con 10% di siero fetale bovino, 1% di L-glutammina, 1% di penicillina/streptomicina.

2. Dulbecco's Modified Eagle Medium integrato con 1% di L-Glutamina, 1% di Penicillina/Streptomicina, 0,2% di Albumina Sierica Bovina, 0,025% di HEPES, DEAE-Destrano 50 µg/ml.

A. Mezzi minimi essenziali 2x (500 ml) integrati con 5% di FBS (25 ml), 1% di aminoacidi minimi essenziali (5 ml), 1% di piruvato di sodio (5 ml), 1% di L-glutammina (5 ml), 2% di Pen/Strep (10 ml).

B. Mezzi Essenziali 2x (500 ml) integrati con 0,2% di Albumina Sierica Bovina, 1% di Aminoacidi Essenziali Minimi (5 ml), 50 µg/ml, 0,025% HEPES, DEAE-Destrano, Tripsina-TPCK*

*Poco prima della preparazione, aggiungere 1 µl ogni 25 ml di una soluzione madre di TPCK-tripsina a 2 µg/ml all'aliquota che verrà utilizzata per mescolare con l'agarosio per i piastrini.

Tabella 3. Soluzioni di base per i sovraspetti

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo di cellula	Vero	Vero	MDCK
Periodo di infezione	1 hr	1 hr	45 min
Tempo di incubazione	3 giorni	2 giorni	3 giorni

 

Tabella 4. Formati delle piastre

	6 pozzetti	12 pozzetti	96 pozzetti
Numero di cellule/pozzetto	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volume dell'inoculo (μl)	400	200	50
Volume del rivestimento (ml)	3	1.5	0.100

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
violetto cristallo	Sigma Aldritch	C3886-25G
Soluzione di formaldeide	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Agitare vigorosamente durante la ricostituzione per >30 min per l'omogeneizzazione
UltraPure agarosio	Invitrogen	16500-100
Carbossimetilcellulosa, sodio sale a viscosità media	Sigma Aldrich	C4888