Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Sommario

Metodo per la dissociazione enzimatica, l'etichettatura e la purificazione della superficie mediante citometria a flusso di fibro / adipogenico e progenitori miogenici da topo muscolo scheletrico.

Abstract

Muscolo scheletrico contiene popolazioni progenitore più di distinte origini embrionale e potenziale di sviluppo. Progenitori miogenici, di solito risiede in una "posizione delle cellule satellite" tra la membrana plasmatica miofibre e la laminina-ricchi membrana basale che ensheaths esso, sono auto-rinnovamento delle cellule che sono esclusivamente impegnati nel ^1,2 lignaggio miogenico. Recentemente abbiamo descritto una seconda classe di progenitori nave associate in grado di generare e miofibroblasti adipociti bianchi, che risponde ai danni da entrare in modo efficace la proliferazione e fornisce supporto trofico per le cellule miogenici durante la rigenerazione dei tessuti ^3,4. Uno dei test più affidabile per determinare il potenziale di sviluppo e rigenerazione di una popolazione di cellule dato si basa sul loro peso e il trapianto di ^5-7. A tal fine abbiamo ottimizzato i protocolli per la loro purificazione mediante citometria di flusso dal muscolo dissociato enzimaticamente, che illustrerà in questo articolo. Le popolazioni ottenuti usando questo metodo contenere cellule colonia miogeniche o fibro / adipogenico formando: non altri tipi di cellule sono in grado di espandere in vitro o sopravvivere in consegna vivo. Tuttavia, quando queste popolazioni vengono utilizzati subito dopo l'ordinamento per l'analisi molecolare (ad es qRT-PCR) si deve tenere presente che i sottoinsiemi appena ordinati può contenere altre cellule agente inquinante che non hanno la capacità di formare colonie o engrafting destinatari.

Protocollo

1. Tessuto Collezione:

1. Utilizzare topi tra 7 e 12 settimane di età. Di solito, almeno due animali sono utilizzati: uno è quello di impostare il FACS monocolore controlli necessari per il risarcimento e per campioni isotipo fluorescenza-meno-un controllo. L'altro è il campione reale per l'ordinamento.
2. Euthanize i topi da CO ₂ inalazione o secondo un protocollo di etica della scelta. Topi posto su un tovagliolo di carta, rivolta verso l'alto, e spruzzare con il 70% di etanolo a fondo per evitare la contaminazione con la pelliccia del mouse.
3. Sollevare la cute nella regione addominale con una pinza, poi fare un piccolo taglio longitudinale con forbici affilate.
4. Sbucciate i due lembi di pelle in direzioni opposte (su e giù) per esporre completamente i muscoli degli arti posteriori sotto.
5. Dell'accisa il tessuto muscolare inserendo ed estendendo le forbici lungo entrambi i lati della tibia.
6. Ripetere la stessa procedura per il femore per estrarre il tessuto muscolare.
7. Mettere tutti i tessuti muscolari asportati in 60 millimetri di Petri-piatti, utilizzando un piatto per il tessuto di ogni topo.
8. Ripetere quanto sopra per tutti i mouse.

2. Dissociare tessuto in cellule singole per digestione enzimatica:

In questa sezione del protocollo, utilizzare i reagenti e strumenti sterili e lavorare in condizioni sterili.

9. Aggiungere 2 ml di Collagenasi II (Sigma, cat # 6885, 500U / mL) e 20 l di 250mm CaCl ₂ magazzino ad ogni Petri-piatto.
10. Lacerare il tessuto muscolare in piccoli pezzi (circa 1 mm ³⁾ con due pinze (una seghettato, una con 2 denti, da Strumenti Scienze Arti, cat # 11051-10, 11154-10), facendo attenzione a rimuovere ed eliminare il più contaminati non-tessuto muscolare possibile.
11. Coprire il Petri-piatti e incubare loro a 37 gradi centigradi per 30 minuti.
12. Recuperare il Petri-piatti e usare una siringa da 3 ml stantuffo a schiacciare a fondo i pezzi di tessuto. Utilizzare uno stantuffo per ogni campione per evitare contaminazioni.
13. Aggiungete un po '(~ 5 ml) PBS freddo sterile ad ogni Petri-piatto e trasferire i fanghi tessuto in un tubo 50mL Falcon (sciacquare la Petri-piatto, se necessario, di recuperare tutti i tessuti)
14. Agitare la provetta Falcon vigorosamente, riempire la provetta con PBS, centrifugare @ 800 giri x 5 minuti (da banco Eppendorf top Modello: 5810R), e aspirare il surnatante (ripetere 3 volte)
15. Aggiungere 1 ml di miscela Collagenasi D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / mL) / dispasi II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) e 10μL di CaCl ₂ (250mm) a ciascuna provetta, incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per un'ora.
16. Aggiungere 5-10 ml di freddo, sterile PBS, vortice e pipetta accuratamente per omogeneizzare il tessuto.
17. Riempire i tubi con PBS e mescolare bene.
18. Trasferire il liquido in un colino cellula 40μm collocato su un tubo 50 ml Falcon per filtrare i pezzi di altri grandi produttori di tessuto. Dividere ogni campione uniformemente in tre 50mL tubi Falcon. Riempire ciascuno dei tubi con PBS quindi si centrifuga @ 1600rpm per 5 minuti a 8 gradi Celsius.
19. Eliminare il supernatante e raccogliere le cellule per la colorazione.

3. Anticorpi colorazione e ordinamento:

In questa sezione del protocollo, l'uso FACS tamponi sterili e la raccolta e il lavoro in condizioni sterili. Anticorpi commerciali sono generalmente considerati sterili se correttamente gestita.

20. Per singolo colore e campioni di controllo isotipico, risospendere il campione in 1 ml di buffer FACS e dividere le cellule sospese in nove 1,5 ml di pre-etichettati tubi Eppendorf (100 l ogni tubo).
    1. Impostare colorazione singolo colore si mescola in base alla seguente tabella:
       ATTENZIONE: La concentrazione finale di anticorpi isotipo di controllo nella macchia dovrebbe corrispondere a quello dell'anticorpo primario sono il controllo. Per esempio, se anti-Sca-1 è usato per 1 μg/10 ⁶ celle, il suo isotipo corrispondente deve essere utilizzato alla stessa concentrazione.
       

       Tubo #	Nome del tubo	Azienda	Cat #	clone	isotipo	diluizione
       1	Non macchia
       2	Hoechst33342	sigma	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	sigma	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	eBioscience	11-0311-85	390	Rat IgG2a	500
       		Fatti in casa		I3 / 2	Rat IgG2b	500
       5	SCA1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	D7	Rat IgG2a	5000
       6	α-7 APC	Fatti in casa		R2F2	Rat IgG2b	1000

    2. Impostare colorazione controllo isotipico mescola con la seguente tabella:
       

       Tubo #	Nome di tubo	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Scal- PE-Cy7	A-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Iso- Scal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Iso- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Pipettare il singolo colore e di isotopi mescola colorazione di controllo (di solito regolare la concentrazione di anticorpi in modo che tra 5 e 10 ml di colorazione miscela vengono aggiunti ad ogni campione) nel tubo Eppendorf appropriato dal punto 20. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora.
21. Macchia cellule di topo campione con 800μL del cocktail di anticorpi (in basso) per l'ordinamento delle cellule FACS. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora.
    Anticorpi cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
    ATTENZIONE: Il rapporto ottimale di anticorpi contro le cellule devono essere determinata individualmente ogni titolazione degli anticorpi, in quanto possono esistere differenze significative tra i lotti. La quantità ottimale di anticorpi da utilizzare devono essere espressi in μgs di anticorpi per 10 ⁶ cellule bersaglio e mantenuta costante durante l'utilizzo dello stesso lotto di anticorpi. Chiaramente, se il numero di cellule bersaglio non cambia significativamente tra gli esperimenti, o se il volume colorazione è in scala con il numero di cellule, una diluizione fisso di ciascun anticorpo può essere utilizzato anche.
22. Lavaggio: Aggiungere circa 1 ml di buffer di FACS per ognuna delle 9 provette di controllo, aggiungere circa 20 mL di tampone FACS alla provetta.
23. Centrifugare le provette Eppendorf @ 3000rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5417C). Centrifugare la provetta @ 1600rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5810R).
24. Aspirare e scartare il supernatante da tutti i tubi.
25. Risospendere le cellule nel buffer FACS (1 ml per ciascuno dei controlli, da 4 ml per il campione ordinamento), le cellule Pipettare in "tubi FACS" attraverso il filtro delle cellule tappo (cat BD Falcon # 352235, 40μm dimensioni dei pori) per rimuovere macchie rimanenti che possono influire sul citometro.
26. Impostare il FACS sorter con controlli singolo colore e controlli isotipo.
27. Raccogliere le cellule ordinati secondo la tabella seguente in un buffer di 3,5 ml di raccolta (95% DMEM, 5% FBS) separatamente. Normalmente, quando la raccolta entrambi gli arti posteriori, un mouse di tipo selvatico potrebbe produrre circa 150.000 cellule progenitrici miogeniche o 100.000 cellule progenitrici adipogenico, con la vitalità superiore al 95%, come giudicato da rianalizzati cellule ordinati per FACS al termine della procedura (Figura 1 )
    Definizione dei progenitori miogenici e adipogenico base alla colorazione della superficie
    

    Anticorpo / macchia	Progenitrici miogenici (MP)	Progenitrici adipogenico (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    SCA1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Trapianto:

28. Centrifugare le cellule ordinati @ 1500rpm per 5 minuti, togliere le cellule surnatante e trasferimento in autoclave i tubi Eppendorf (1,5 ml), lavare le cellule con 500 l di PBS sterile (i livelli di free!), Quindi si centrifuga @ 3000rpm per 5 minuti. Il mantenimento di tutti i reagenti in condizioni sterili e lavorare in un cappuccio colture di tessuti, risospendere progenitori miogenici in PBS, o progenitrici adipogenico in Matrigel (BD cat # 354234) a circa 10 ⁶ cellule / ml.
29. Trapianto di progenitori miogenici o progenitrici adipogenico ai topi destinatario.
    1. Anestetizzare il mouse con isoflouran secondo la vostra politica istituzione.
    2. Radersi i capelli intorno alla regione di iniezione, poi sterilizzare la pelle strofinando con etanolo al 70%
    3. Iniettare 20μL dei progenitori miogenici o progenitori adipogenico (= 20k cellule) con un 3 / 10 siringa da insulina CC (cat BD # 309300).
30. Dopo un tempo adeguato (tre settimane funziona bene, ma miofibre transgenici che esprimono i marcatori del donatore-derivati ​​sono di solito evidenti entro una settimana dopo il trapianto), anestetizzare i topi destinatario da passaggio 29 mediante iniezione intraperitoneale di 400 microlitri Avertin (Cat Sigma # T04840-2, 25 mg / ml), poi profumato transcardially con 50mL PBS (contiene 10 mM di EDTA) per primo, seguito da 15 ml del 4% PFA. Raccogliere tessuto bersaglio, post-fix con 4% PFA durante la notte, se necessario, poi il trasferimento al 20% di saccarosio durante la notte. Incorpora in ottobre, congelare e cryosection.

5. Rappresentante dei risultati:

MP quando vengono trapiantate nel muscolo scheletrico del mouse, che prontamente si fondono con pre-esistente miofibre. Pertanto, qualsiasi etichetta genetico presente nelle cellule del donatore sarà facilmente individuabile nelle fibre che li ha accolti. La figura 2 mostra un esempio in cui le cellule trapiantate espresso umane phostphatase alcalino, ha rivelato istochimicamente.

AP quando vengono trapiantate il risultato dipende in larga misura l'ambiente del sito trapianto: quando queste cellule trapiantate per via sottocutanea dare origini a adipociti e miofibroblasti (vedi figura 2). In molti altri siti, compresi i muscoli, non sopravvivono a meno degenerazione grassa è stata indotta ^3.

Figura 1. Ordinamento strategia per l'isolamento delle popolazioni progenitrici dal muscolo scheletrico (A) strategia Ordinamento:. Cellule vitali sono state identificate sulla base di dispersione in avanti e side scatter. Colorazione Hoechst è stato utilizzato per escludere detriti anuclear e ioduro di propidio (PI) colorazione di escludere le cellule morte. Ematopoietiche (CD45) ed endoteliali (CD31), le cellule sono state escluse dalle porte di smistamento. Il α7 ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- Scal ^- sottoinsieme contiene tutti i progenitori miogenici (MP). Il Scal ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- popolazione contiene progenitori adipogenico (AP). (B) Fluorescenza-minus-one (FMO) controlla isotipo confermare la specificità della macchia. (C) Purezza controlli di sottoinsiemi MP e AP dopo l'ordinamento.

Figura 2. Risultati rappresentativi seguenti MP e AP di trapianto. AP sono stati trapiantati per via sottocutanea (pannello superiore) e MP per via intramuscolare (pannello inferiore). In entrambi i casi, le cellule del donatore origine da un topo transgenico che esprime fosfatasi alcalina umano, identificato dalla colorazione marrone.

Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di trovare un equilibrio ragionevole tra alti rendimenti e alti vitalità delle cellule purificate. La fase più critica per garantire che le cellule sane sono state recuperate è, prevedibilmente, la dissociazione enzimatica del tessuto di partenza. Il trattamento del tessuto deve essere particolarmente delicato, che è difficile da dimostrare o apprezzare anche in un formato audiovisivo. Un altro fattore chiave è la durata della procedura. Più a lungo ci vuole per andare dal donatore al ricevente l'animale, minore è la vitalità e, quindi, l'efficienza attecchimento. In caso di domanda sulla vitalità che non è immediatamente risposto, cercando alla frequenza di eventi PI positivi nei campioni di cellule purificate dopo l'ordinamento, si consiglia un test di diluizione limita a misurare clonogenicità viene eseguita ^3. Sorta tipici muscolo danneggiato regolarmente resa di circa 1 in 15-20 cellule in grado di avviare colonie miogenici o fibro / adipogenico in vitro. Mentre praticamente del 100% delle colonie avviato da parlamentari contenere miotubi differenziati, solo circa un terzo delle colonie ottenute da FAP contenere adipociti oltre a miofibroblasti actina del muscolo liscio positivi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 U / ml
Collagenasi D	Roche	11088882001	1,5 U / ml
Spostare II	Roche	04942078001	2,4 u / ml
cellula filtro	BD	352340	40 micron
Tubo con filtro cellulare	BD	352235	40 micron
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug / ml
CD31-FITC	Ebiosciences	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Fatto in casa		Clone I3 / 2
SCA1-PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	Clone D7
α-7 integrina APC	Fatto in casa	Informarsi con Rossi laboratorio	R2F2