Come nicchie e le cellule staminali si formano durante lo sviluppo è una questione importante con implicazioni pratiche. Nel Drosophila, germe di cellule staminali e la loro linea di nicchie somatiche formano durante lo sviluppo larvale. Questo video mostra come sezionare, macchia e montare gonadi femminili dalla fine del III instar (LL3) Drosophila Larve.
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Articolo metodologico
Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti organi dipendono da cellule staminali per il loro sviluppo durante l'embriogenesi e per la manutenzione o la riparazione durante la vita adulta. Capire come le cellule staminali forma, e come interagiscono con l'ambiente è quindi cruciale per la comprensione dello sviluppo, l'omeostasi e malattia. Dell'ovaio del moscerino della frutta Drosophila melanogaster ha servito come modello influente per l'interazione delle cellule staminali della linea germinale (GSCs) con le loro cellule somatiche di supporto (di nicchia) 1, 2. La posizione nota della nicchia e la GSCs, unita alla capacità di manipolare geneticamente, ha permesso ai ricercatori di chiarire una serie di interazioni tra cellule staminali e le loro nicchie 3-12.
Nonostante la ricchezza di informazioni sui meccanismi che controllano la manutenzione GSC e differenziazione, relativamente poco si sa su come GSCs e le loro nicchie di somatico forma durante lo sviluppo. Circa 18 nicchie somatiche, il cui cellulare componenti includono filamento terminale e cellule tappo (Figura 1), si formano durante la terza larvale instar 13-17. GSCs originano dalle cellule germinali primordiali (PGC). PGC proliferano in primi stadi larvali, ma in seguito alla formazione della nicchia un sottogruppo di PGC diventa GSCs 7, 16, 18, 19. Insieme, le cellule somatiche di nicchia e la GSCs fare una unità funzionale che produce uova per tutta la vita dell'organismo.
Molte domande riguardanti la formazione del gruppo GSC rimangono senza risposta. Processi quali il coordinamento tra le cellule precursore per nicchie e precursori di cellule staminali, o la generazione di asimmetria all'interno PGC man mano che diventano GSCs, può essere meglio studiato nella larva. Tuttavia, uno studio metodico di sviluppo dell'ovaio larvale è fisicamente impegnativo. In primo luogo, le ovaie sono piccole larve. Anche al fine di stadi larvali sono solo 100μm di diametro. Inoltre, le ovaie sono trasparenti e sono integrati in un corpo grasso bianco. Qui si descrive passo per passo il protocollo per isolare ovaie da fine del III instar (LL3) larve di Drosophila, seguita dalla colorazione con anticorpi fluorescenti. Vi offriamo alcune soluzioni tecniche a problemi quali localizzare le ovaie, colorazione e lavaggio dei tessuti che non affondare, e fare in modo che gli anticorpi penetrano nel tessuto. Questo protocollo può essere applicato a stadi precedenti larvali e di testicoli larvale pure.
Protocollo
1. La deposizione delle uova
- Cinque giorni prima della dissezione: permette femmine accoppiate per deporre le uova per 2-4 ore con cibo fresco integrato con il lievito. Per ottenere larve sincronizzato e ben sviluppato, è importante non avere colto sovraffollamento (circa 30 uova / fiala 25mm). Tipicamente, 7-16 femmine sono utilizzati per flaconcino, a seconda di quanto bene laici.
2. Selezione larve
- Preparare un 9-ben piatto di vetro riempita con mezzo di dissezione Ringer (128mm NaCl, 2mM KCl, CaCl 2 1,8 mm, 4mm MgCl 2, 35.5mm saccarosio, 5mm Hepes pH 6,9).
- Preparare filtri ce....
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Discussione
Questo video dimostra un isolamento e il protocollo di colorazione della fine del III instar ovaie larvale. Per eseguire questo protocollo di routine e in modo affidabile, l'attenzione dovrebbe essere prestata ai seguenti punti:
- Per le larve sincronizzati e ben sviluppato, oltre affollamento deve essere evitato.
- Per evitare la perdita delle ovaie piccole traslucido, assicurarsi di sezionare il corpo di grasso intatto. Questo aiuterà anche a trovare le ovaie in fase di montaggio, in particolare.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
IM è supportato dal Marie Curie di reintegrazione di sovvenzione. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo non Scienza Israele Grant. 1146-1108, da Helen e Martin Kimmel Istituto per la ricerca sulle cellule staminali presso il Weizmann Institute of Science e la Fondazione Leir beneficenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrosio | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumina Bovina Frattione V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Pinzette biologiche Dumont 5 dumstar lucidate | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Portapuntine nichelato | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Puntine minutien in acciaio, diametro 0,1 mm, lunghezza 10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Piastre a 9 pozzetti, 85x100 mm, diametro esterno 22 mm x profondità 7 mm | Corning | 7220-85 | |
| Microscopio stereoscopico MZ 16.5 con base standard per luce trasmessa TL ST | Leica Microsystems | ||
| Piastre a 6 pozzetti | Costar | 3516 | |
| Vetrini | Menzel-Glaser | 798 | |
| Coprioggetti | Corning | 2940-223 | |
| Mezzi di montaggio | Vectashield | H-1200 | |
| Filtro cellulare | Falcon BD | FAL352350 | |
| Anticorpo 1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratorio del Dott. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratorio del Dott. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galattosidasi | Cappel | ||
| Anticorpi secondari | Jackson ImmunoResearch |
Riferimenti
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
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Ristampe e permessi
