Un modo semplice per misurare sensibilità etanolo in Flies

Sommario

Un test semplice per misurare gli effetti sedativi di etanolo Drosophila Mosche, basato sulla perdita del riflesso di raddrizzamento, è descritto.

Abstract

Basse dosi di etanolo causa vola a diventare iperattivi, mentre alte dosi sono sedativi. La sensibilità all'etanolo sedazione indotta di un ceppo di volare dato è correlato con la preferenza etanolo che il ceppo s, e quindi la sedazione è una misura molto rilevante per studiare la genetica di risposte e di bere alcolici. Si dimostra un modo semplice di esporre vola a etanolo e misurare i suoi effetti inebrianti. Il test che descriviamo in grado di determinare la sensibilità acuta, così come la tolleranza etanolo indotta da esposizione ripetuta. Non richiede una configurazione tecnica in gioco e possono quindi essere applicato in qualsiasi laboratorio con strumenti di base della cultura volare.

Protocollo

1. Creazione della camera di esposizione

1. Tagliare una spina fiala a metà con una lama di rasoio. In alternativa, utilizzare batuffoli di cotone.
2. Spingere la metà spina fiala, o il batuffolo di cotone, sul fondo del flacone cibo per fare una superficie liscia che vola non si blocca in
3. Se rendendo camere di esposizione multipla, accertarsi che la spina flaconcino e cibo occupano lo stesso volume in ogni camera. Un segno sul lato del flaconcino può facilitare questo.

2. Esponendo le mosche

1. Colleziona 8 vola di un sesso, età 1-5 giorni, il giorno prima dell'esposizione in flaconi cibo normale, senza lievito.
2. Etichettarli in codice, in modo che lo sperimentatore è cieco al genotipo reale / ceppo usato.
3. Trasferire le otto vola nelle camere di esposizione toccando. Non anestetizzare.
4. Aggiungere una piccola quantità di colorante alimentare, ad esempio acido blu 9, a 200 etanolo prova per renderlo facilmente visibile.
5. Rivestire il fondo di una spina fiala, o batuffolo di cotone, con 0,5 ml di etanolo.
6. Inserire la spina di etanolo nel flaconcino di esposizione. Assicurarsi che l'alcol è rivolto nel flaconcino, e non verso la parete del flaconcino.
7. Avviare un timer che conta su.

3. Record etanolo-indotta intossicazione

1. Ogni minuto dopo che il timer viene avviato, toccare la camera di esposizione in panchina far trasalire le mosche e osservare per dieci secondi.
2. Registrare il numero di mosche stazionaria per ogni minuto. Le mosche sono stazionari se non possono scendere le spalle, rimangono in una posizione, o in rapida vibrare le ali durante l'intero dieci secondi periodo di osservazione. Le mosche ultimi sono considerati fissi, perché la stragrande maggioranza di queste mosche sono fermi tra i periodi di rapido movimento dell'ala. Le mosche non sono stazionari se possono scendere le spalle e piedi e / o sulla parete flaconcino.
3. Una prova di esposizione è terminata quando 4 o più mosche sono registrate come stazionaria.
4. Gettare le mosche e lasciare che l'aria camera di esposizione per poi riutilizzare.

4. Determinare il tempo al 50% sedazione

Il tempo per il 50% sedazione (ST50) è il tempo dopo l'inizio dell'esposizione etanolo quando quattro degli otto mosche rimangono stazionari. Ciò è determinato come segue:
In entrambi i casi: il minuto prima misurazione quando esattamente quattro mosche sono stazionarie.
Oppure: se meno di quattro mosche (Y1) sono fermi ad un certo punto il tempo (minuti X), e più di quattro (Y2) al punto successivo tempo di misura (minuti X +1), poi linearmente interpolare i ST50 con la formula:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. Ripetere l'esposizione di determinare tolleranza

Esponendo le mosche

1. Determinare la ST50 (peso) per la wild-type di controllo utilizzati nell'esperimento.
2. Esporre i gruppi sperimentali di mosche in etanolo come descritto sopra.
3. Misurare la loro ST50 (1), ma continua a esporre fino a raggiungere il tempo 2x ST50 (in peso).
4. Trasferire le mosche nuovamente dentro una fiala vuota cibo, e tenere premuto per 4 ore.
5. Ri-esporre le mosche, e determinare il ST50 (2) di esposizione 2.

Determinare tolleranza

Calcolare la tolleranza in% (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.

6. Rappresentante dei risultati:

Qui, ci sono alcuni risultati rappresentativi abbiamo ottenuto con 6-8 fiale di mosche per genotipo e la dose. Se l'errore standard è sostanzialmente più grande, poi un problema sistematico probabilmente si è verificato. Assicurarsi che l'etanolo si affaccia nelle camere di esposizione, e che le camere sono lo stesso volume.

Figura 1. Curva dose-risposta di tipo selvatico vola esposti a percentuali crescenti di etanolo. Otto fiale di mosche sono state esposte per dose e sesso. Moscerini maschi e femmine mostrano la ST50 stesso ad ogni dose (p> 0,22, 2-way ANOVA), mentre l'ST50 attraverso le dosi riduce significativamente con l'aumento della dose di etanolo (p <0,001). Si noti che vola da sovraffollati bottiglie possono essere notevolmente più piccoli di quelli da bottiglie sano, e questa differenza di dimensioni può influenzare la ST50. Semi di ogni bottiglia con le femmine 15-20 che per 1-2 giorni per ottenere la densità ottimale larvale a bottiglia.

Figura 2. Esporre vola a uno etanolo al 90%, o 100% riproduce descritti in precedenza etanolo-resistenza causata dal bianco rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA).

Figura 3. Ripetete l'esposizione al 100% di etanolo, distanziate da un intervallo di recupero di 4 ore, causa un significativo aumento ST50 dopo la seconda esposizione (p <0,001, paired t-Test). Si noti che le mosche sono stati esposti per 24 minuti durante la prima esposizione (corrispondente al doppio della loro ve na ST50). Esposizione per un tempo più corto (12 minuti) non ha causato un aumento significativo ST50 su ri-esposizione (dati non riportati).

Discussione

In questa presentazione, abbiamo delineato un modo semplice per determinare l'etanolo-indotta intossicazione sulla base di precedenti saggi descritto da Bainton et al. 2000 ^1, e Rothenfluh et al. 2006 ^2. Dal momento che l'alcol-indotta sedazione è correlato con la preferenza di bere alcolici ^3, questo saggio è rilevante per lo studio dei disturbi da uso di alcol. Il test descritto è basato sulla geotassi negativo sussultare-indotta, e come un'esposizione di alcol interferisce con questa risposta innata. Prima di iniziare le esposizioni, assicurarsi che tutti i moscerini mostrano una normale risposta a un tale spavento, cioè dopo aver premuto verso il basso le mosche nel flacone cibo, esse dovrebbero salire dal basso in una volta 10 seconda osservazione. Esempi di mosche aver ridotto geotassi negativi includono bang-sensibili mutanti sequestro ^5, e locomozione con deficit vola causati dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici ^6.

Anche se il test descritto è relativamente semplice, due variabili meritano la massima attenzione per garantire risultati riproducibili. In primo luogo, tutti i flaconcini esposizione dovrebbe essere lo stesso volume. Ciò include fare in modo che la parte inferiore della fiala contiene la stessa quantità di cibo + fiala spina / cotone palla, così come l'inserimento della spina etanolo contenenti la stessa distanza per ogni flacone. Un flaconcino completamente vuoto può essere utilizzato per questa analisi, ma porta a valori più ST50, diminuendo la velocità del test.

Questo test è adatto anche per determinare la quantità di mosche sviluppare tolleranza in caso di esposizione ripetuta etanolo. Un certo numero di variabili devono essere considerati quando si fa esposizioni ripetute. In primo luogo, l'inter-esposizione intervallo è qui descritta come 4 ore. Questa variabile può essere cambiato, ma si raccomanda di non essere inferiore a 2 ore, per garantire uno spazio di etanolo dalla prima esposizione. Vedi Scholz et al. 2000 ⁴ per la cinetica di sviluppo dell'etanolo tolleranza e di degrado. La seconda variabile da considerare è la durata della prima esposizione. Questo è ovvio che essere lo stesso per il controllo e le mosche sperimentale. Tuttavia, questo non può comportare la stessa quantità di etanolo consegnato ad entrambi questi ceppi volare. Vola sedato assorbono più etanolo che vola attivo ^2, quindi un ceppo che seda anteriore può ricevere una dose maggiore di un sedativo dopo ceppo e, quindi, sviluppare una maggiore tolleranza a causa di una dose iniziale più elevato. Siamo fermamente avvisare il lettore durante il confronto lo sviluppo di tolleranza di ceppi che mostrano le differenze nei primi ST50 (1).

Il test che descriviamo qui è uno strumento utile in modo semplice e riproducibile per determinare le risposte comportamentali vola ad alcol.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per esposizione	www.flystuff.com	32-116
Tappi	www.flystuff.com	49-102
Acid Blue 9	Sigma-Aldrich	861146