Clonogenica saggio: cellule aderenti

Sommario

L'applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.

Abstract

Il (o ​​formanti colonie) clonogenica saggio è stato stabilito per più di 50 anni, la carta originale che descrive la tecnica è stata pubblicata nel 1956 ^1. Oltre a documentare il metodo, lo studio punto di riferimento iniziale generato la prima dose di radiazioni curva di risposta per i raggi X irradiato mammiferi (HeLa), le cellule in coltura ^1. Fondamentalmente, il saggio clonogenica consente una valutazione delle differenze di vitalità riproduttiva (capacità delle cellule di produrre progenie, cioè una singola cellula a formare una colonia di 50 o più cellule) tra le cellule di controllo non trattato e le cellule che hanno subito diversi trattamenti come l'esposizione a radiazioni ionizzanti, composti chimici vari (es. agenti citotossici) o in altri casi la manipolazione genetica. Il test è diventata la tecnica più ampiamente accettata in biologia radiazioni ed è stato ampiamente utilizzato per valutare la sensibilità alle radiazioni di diverse linee cellulari. Inoltre, il saggio clonogenica è comunemente usato per monitorare l'efficacia di composti radiazioni modifica e per determinare gli effetti di agenti citotossici e di altre terapie anti-cancro sulla capacità formanti colonie, in diverse linee cellulari. Un tipico esperimento di sopravvivenza clonogenica utilizzando linee di cellule aderenti coinvolge tre componenti distinte, 1) il trattamento del monostrato cellulare in flaconi colture di tessuti, 2) preparazione di sospensioni singola cellula e placcatura un adeguato numero di cellule in piastre di Petri e 3) di fissaggio e colorazione colonie dopo un periodo di incubazione rilevante, che potrebbe variare da 1-3 settimane, a seconda della linea cellulare. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con linee cellulari aderenti con l'utilizzo di una linea cellulare umana immortalata cheratinociti (FEP-1811) ^2. Inoltre, i nostri obiettivi sono quelli di descrivere caratteristiche comuni di test clonogenica compreso il calcolo del rendimento della placcatura e le frazioni di sopravvivenza dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni, e per esemplificare la modifica della radiazione-risposta con l'utilizzo di una formulazione antiossidante naturale.

Protocollo

1. Cellule Cultura e set-up sperimentale

1. Cheratinociti umani sono mantenuti come monostrati in 75 fiaschi tessuto cm ² di coltura contenente 15 mL di cheratinociti-SFM (K-SFM) media (GIBCO, mezzo privo di siero) arricchito con L-glutamina (2 mm), fattore di crescita epidermico (5 ng / mL), estratto di ipofisi bovina (40 mg / ml) e 20 mg / mL di gentamicina. Le cellule sono coltivate in umidificata al 5% CO ₂ ambiente a 37 ° C.
2. Le cellule vengono seminate in 12 x 25 cm ² di tessuto fiasche di coltura contenente 5 ml di K-SFM media.

Sospensioni singola cella sono preparati da trips....

Discussione

In questo esempio umano FEP-1811 cheratinociti sono stati trattati con diverse concentrazioni fino a 100 mg / ml CPF; dato viene mostrato per 20 mg / mL CPF per 1 ora a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono state irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Per i trattamenti di controllo non trattato solo di droga e 100 cellule sono state placcate in ogni capsula di Petri e 1000 cellule per piatto sono stati p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreno libero da siero cheratinociti	Terreno di crescita	Invitrogen	17005042	Integrato con 2mM di L-glutammina, 20μ g/ml di gentamicina, fattore di crescita epidermico, estratto di ipofisi bovina.
Tripsina-EDTA		Invitrogen	15400-054	0,05% tripsina / EDTA per staccare le cellule aderenti; 10 x stock diluito in PBS senza Ca2+/Mg2+.
Dulbecco' s terreno essenziale modificato	Terreno di crescita	Invitrogen	11885-084	Integrato con il 10% di FBS e 20μ g/ml di gentamicina; utilizzato per neutralizzare la tripsina/EDTA.
Soluzione			salina allo 0,09%	Utilizzata per lavare le colonie.
Soluzione di formalina tamponata neutra al 10%		Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldeide; utilizzata per fissare le colonie.
Polvere di cristallovioletto		SPI Fornisce	02577-MB	0,01% soluzione di cristallovioletto, preparata in dH2O, utilizzata per colorare le colonie.
	d'élite Gammacell 1000	Nordion International Inc.
piastre di Petri	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Emocitometro		Hawksley; Scatola
Scatola di plastica con fori praticati ai lati opposti del coperchio; per la conservazione di piastre di Petri durante l'incubazione prolungata per la formazione di colonie.
Stereomicroscopio	Tipo 102	Strumenti Nikon		Utilizzato per contare colonie costituite da > 50 celle.