L'applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.
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Articolo metodologico
Clonogenica saggio: cellule aderenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il (o formanti colonie) clonogenica saggio è stato stabilito per più di 50 anni, la carta originale che descrive la tecnica è stata pubblicata nel 1956 1. Oltre a documentare il metodo, lo studio punto di riferimento iniziale generato la prima dose di radiazioni curva di risposta per i raggi X irradiato mammiferi (HeLa), le cellule in coltura 1. Fondamentalmente, il saggio clonogenica consente una valutazione delle differenze di vitalità riproduttiva (capacità delle cellule di produrre progenie, cioè una singola cellula a formare una colonia di 50 o più cellule) tra le cellule di controllo non trattato e le cellule che hanno subito diversi trattamenti come l'esposizione a radiazioni ionizzanti, composti chimici vari (es. agenti citotossici) o in altri casi la manipolazione genetica. Il test è diventata la tecnica più ampiamente accettata in biologia radiazioni ed è stato ampiamente utilizzato per valutare la sensibilità alle radiazioni di diverse linee cellulari. Inoltre, il saggio clonogenica è comunemente usato per monitorare l'efficacia di composti radiazioni modifica e per determinare gli effetti di agenti citotossici e di altre terapie anti-cancro sulla capacità formanti colonie, in diverse linee cellulari. Un tipico esperimento di sopravvivenza clonogenica utilizzando linee di cellule aderenti coinvolge tre componenti distinte, 1) il trattamento del monostrato cellulare in flaconi colture di tessuti, 2) preparazione di sospensioni singola cellula e placcatura un adeguato numero di cellule in piastre di Petri e 3) di fissaggio e colorazione colonie dopo un periodo di incubazione rilevante, che potrebbe variare da 1-3 settimane, a seconda della linea cellulare. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con linee cellulari aderenti con l'utilizzo di una linea cellulare umana immortalata cheratinociti (FEP-1811) 2. Inoltre, i nostri obiettivi sono quelli di descrivere caratteristiche comuni di test clonogenica compreso il calcolo del rendimento della placcatura e le frazioni di sopravvivenza dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni, e per esemplificare la modifica della radiazione-risposta con l'utilizzo di una formulazione antiossidante naturale.
Protocollo
1. Cellule Cultura e set-up sperimentale
- Cheratinociti umani sono mantenuti come monostrati in 75 fiaschi tessuto cm 2 di coltura contenente 15 mL di cheratinociti-SFM (K-SFM) media (GIBCO, mezzo privo di siero) arricchito con L-glutamina (2 mm), fattore di crescita epidermico (5 ng / mL), estratto di ipofisi bovina (40 mg / ml) e 20 mg / mL di gentamicina. Le cellule sono coltivate in umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C.
- Le cellule vengono seminate in 12 x 25 cm 2 di tessuto fiasche di coltura contenente 5 ml di K-SFM media.
Sospensioni singola cella sono preparati da trips....
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Discussione
In questo esempio umano FEP-1811 cheratinociti sono stati trattati con diverse concentrazioni fino a 100 mg / ml CPF; dato viene mostrato per 20 mg / mL CPF per 1 ora a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono state irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Per i trattamenti di controllo non trattato solo di droga e 100 cellule sono state placcate in ogni capsula di Petri e 1000 cellule per piatto sono stati p.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). HR è supportato da un australiano post-laurea e premi BakerIDI scintilla luminosa. Questo lavoro è finanziato dal CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), istituito e sostenuto nell'ambito del programma di ricerca cooperativa del governo australiano Centri. CO è il destinatario un australiano post-laurea e un premio CRC-BID borsa di studio integrativa.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Mezzo privo di siero per cheratinociti | Mezzo di crescita | Invitrogen | 17005042 | Supplementato con 2 mM L-glutammina, 20μg/ml di gentamicina, fattore di crescita epidermico ed estratto di ipofisi bovina. |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Tripsina 0,05% / EDTA per staccare le cellule aderenti; soluzione stock 10x diluita in PBS senza Ca2+/Mg2+. | |
| Mezzo essenziale modificato di Dulbecco’s | Mezzo di crescita | Invitrogen | 11885-084 | Supplementato con 10% di FBS e 20μg/ml di gentamicina; utilizzato per neutralizzare la tripsina/EDTA. |
| Soluzione salina 0,09% | Soluzione | Utilizzata per lavare le colonie. | ||
| Soluzione formale 10% neutra tampone | Soluzione | Sigma-Aldrich | HT501128 | Circa 4% di formaldeide; utilizzata per fissare le colonie. |
| Violetto cristallo | Polvere | SPI Supplies | 02577-MB | Soluzione di violetto cristallo allo 0,01%, preparata in H2O, utilizzata per colorare le colonie. |
| Irradiatore Gammacell 1000 elite | Nordion International Inc. | |||
| Piastre di Petri | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Emocitometro | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Scatola per clonazione | Scatola di plastica con fori praticati su lati opposti del coperchio; utilizzata per conservare le piastre di Petri durante l'incubazione prolungata per la formazione di colonie. | |||
| Stereomicroscopio | Modello 102 | Nikon Instruments | Utilizzato per contare le colonie costituite da >50 cellule. |
Riferimenti
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88,....
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Ristampe e permessi
