$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cellule Cultura e set-up sperimentale
- Cheratinociti umani sono mantenuti come monostrati in 75 fiaschi tessuto cm 2 di coltura contenente 15 mL di cheratinociti-SFM (K-SFM) media (GIBCO, mezzo privo di siero) arricchito con L-glutamina (2 mm), fattore di crescita epidermico (5 ng / mL), estratto di ipofisi bovina (40 mg / ml) e 20 mg / mL di gentamicina. Le cellule sono coltivate in umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C.
- Le cellule vengono seminate in 12 x 25 cm 2 di tessuto fiasche di coltura contenente 5 ml di K-SFM media.
Sospensioni singola cella sono preparati da tripsinizzazione. Le cellule sono lavate con tampone fosfato e incubate con un 0,05% tripsina / EDTA soluzione per 5-10 minuti. Quando le cellule iniziano a diventare arrotondate e ~ 30% individuale, da 3 volumi di medie Dulbecco modificato aquila contenente il 10% di siero fetale bovino viene aggiunto per neutralizzare la tripsina. Le cellule sono staccati pipettando su e giù (20 volte). Le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro.
Numero di cellule appropriate sono teste di serie in base al tempo di raddoppio della linea cellulare (circa 20 ore per l'uomo FEP-1811 cheratinociti). Lo scopo è quello di raggiungere confluenza ~ 90% (~ 10 6 cellule per cilindro), il giorno dell'esperimento.
Un esperimento composto da 12 fiaschi è ottimale per un singolo test clonogenica (sei controllo irraggiati e sei fiaschi irradiati) che può essere completato in circa quattro ore.
2. Trattamento e irradiazione
- Curare le cellule per un tempo adeguato con un contenuto significativo radiazioni modificando composto ed esporre le cellule a radiazioni ionizzanti o γ-radiazioni o raggi-X.
Tipicamente sei fiaschi servire come efficienza placcatura (non trattato) e controlli unico farmaco. Gli altri sei palloni sono irradiati.
In questo esempio cheratinociti umani sono trattati con varie concentrazioni di Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals integrità internazionale, Spring Hill, TN, Stati Uniti; dati rappresentativi per 20 mg / ml è indicato sotto), una formulazione idrosolubile antiossidante naturale, per 1 ora a 37 ° C. Le cellule sono irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min).
3. Placcatura
- Dopo il trattamento, sospensioni singola cella sono ottenuti come descritto in precedenza.
- Il numero di cellule in ogni campione sono contati con cura utilizzando un emocitometro e diluito in modo tale che il numero di cellule appropriate sono seminati in piastre di Petri (cinque repliche di ciascuno in 15 piatti mm).
La placcatura efficienza e / o sopravvivere frazione dovrebbe essere anticipato al momento di decidere il numero di cellule alle sementi per piastra. Lo scopo è quello di raggiungere una gamma di fra 20 - 150 colonie. Piastre di Petri sono disposti in una scatola umidificata clonazione di plastica e incubate in un 5% di CO 2 ambiente a 37 ° C per la formazione di colonie.
Il tempo di incubazione per la formazione di colonie varia da 1-3 settimane per le diverse linee cellulari, è accettato che il tempo deve essere pari ad almeno sei divisioni cellulari. In questo esempio, i piatti di controllo per cheratinociti umani richiedono otto giorni per formare cloni sufficientemente ampio costituito da 50 o più celle.
4. Fissaggio e colorazione Colonie
Completare i seguenti passaggi in una cappa aspirante.
- Delicatamente rimuovere il supporto da ciascuna delle piastre per aspirazione.
- Lavare ogni piatto con 5 ml di soluzione salina allo 0,9%.
- Fissare le colonie con 5 ml di soluzione neutra al 10% formalina tamponata per 15-30 minuti.
- Macchia viola con 5 ml 0,01% (w / v) di cristallo nella dH 2 O per 30-60 minuti.
- Lavare viola eccesso di cristallo con dH 2 O e lasciare i piatti ad asciugare.
5. Conteggio delle colonie
Stereomicroscopio
- Colonie contenenti più di 50 celle singole si contano utilizzando uno stereomicroscopio.
Digital imaging e il conteggio utilizzando software di imaging
- Le immagini digitali delle colonie sono ottenuti utilizzando una fotocamera o dispositivo di scansione
- Le colonie sono contate utilizzando l'imaging pacchetti software di analisi come descritto di seguito.
Conta delle cellule usando ImageJ (Fiji versione 1.44a)
- Aprire il file immagine in Fiji, andare su File -> Apri.
- Se necessario convertire l'immagine in formato 8-bit, vai su Immagine -> Regola Soglia ...->.
- Regolare la soglia di ridurre i livelli di non-specifico background in modo che solo le colonie vengono rilevati.
- Contare le colonie con la seguente: andare al processo - Binary> -> Trova maxima.
Per questo formato di immagine, la tolleranza rumore può essere impostato a 0. Assicurarsi che l'opzione di fondo della luce sia selezionata e visualizzare in anteprima i massimi rilevati per verificare che tutte le colonie di cellule sono stati correttamente registrati.