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Singolo microscopia elettronica di particelle (EM) la ricostruzione è recentemente diventato uno strumento popolare per ottenere il tridimensionale (3D) struttura di complessi macromolecolari di grandi dimensioni. Rispetto alla cristallografia a raggi X, presenta alcuni vantaggi unici. In primo luogo, singola particella EM ricostruzione non ha bisogno di cristallizzare il campione, che è il collo di bottiglia in cristallografia a raggi X, soprattutto per i grandi complessi macromolecolari. In secondo luogo, non ha bisogno di grandi quantità di campioni di proteine. Rispetto ai milligrammi di proteine necessarie per la cristallizzazione, singola particella ricostruzione EM deve solo alcuni micro-litri di soluzione proteica al nano-molare concentrazioni, utilizzando il metodo di colorazione negativa EM. Tuttavia, nonostante un paio di assemblee macromolecolari con simmetria alto, singola particella EM è limitata ad una risoluzione relativamente bassa (inferiore a 1 nm risoluzione) per molti esemplari specialmente quelli privi di simmetria. Questa tecnica è inoltre limitato dalle dimensioni delle molecole in fase di studio, cioè 100 kDa per i campioni negativamente colorati e 300 kDa per frozen-idratata esemplari in generale.
Per un nuovo campione di struttura sconosciuta, si usano generalmente una soluzione di metalli pesanti di inserire le molecole di colorazione negativa. Il campione viene poi esaminato al microscopio elettronico a trasmissione di prendere due-dimensionali (2D) micrografie delle molecole. Idealmente, le molecole di proteine hanno una struttura omogenea 3D, ma presentano diversi orientamenti nelle micrografie. Queste micrografie sono digitalizzati ed elaborati in computer come "particelle singolo". Utilizzando bidimensionale allineamento e tecniche di classificazione, le molecole omogeneo le stesse idee sono raggruppati in classi. Loro medie potenziare il segnale di forme 2D della molecola. Dopo aver assegnato le particelle con il corretto orientamento relativo (angoli di Eulero), saremo in grado di ricostruire le immagini delle particelle 2D in un volume virtuale in 3D.
Nella ricostruzione di singole particelle 3D, un passo essenziale è quello di assegnare correttamente il corretto orientamento di ogni singola particella. Ci sono diversi metodi per assegnare la visualizzazione per ogni particella, compresa la ricostituzione angolare 1 e casuale conica tilt (RCT) metodo 2. In questo protocollo, si descrive la nostra pratica a ottenere la ricostruzione 3D del complesso lievito exosome con colorazione negativa EM e RCT. Va notato che il nostro protocollo di microscopia elettronica e l'elaborazione delle immagini segue il principio di base della RCT, ma non è l'unico modo per eseguire il metodo. Abbiamo prima descritto come incorporare il campione in uno strato di uranile-formiato con uno spessore paragonabile alle dimensioni delle proteine, utilizzando una griglia di carbonio bucata coperta da uno strato continuo di pellicola sottile di carbonio. Poi il campione viene inserito in un microscopio elettronico a trasmissione per raccogliere Untilted (0-laurea) e inclinata (55 gradi) paia di micrografie che verranno utilizzati in seguito per l'elaborazione e ottenere un primo modello 3D del exosome lievito. A tal fine, noi dobbiamo fare RCT e poi affinare il modello iniziale 3D utilizzando la proiezione di corrispondenza metodo raffinatezza 3.