Rifiuto di fluorescenza di fondo in risonanza e spontanea microspettroscopia Raman

Sommario

Discutiamo la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza ultraveloci tutto-ottici di commutazione per isolare Raman da segnali di fluorescenza. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza utilizzando le energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri.

Abstract

Spettroscopia Raman è spesso afflitto da un forte background fluorescente, in particolare per i campioni biologici. Se un campione viene eccitato con un treno di impulsi ultraveloci, un sistema che può separare spettralmente temporalmente sovrapposti segnali su una scala temporale picosecondo possibile isolare tempestivamente arriva Raman luce diffusa dal tardo arrivo luce di fluorescenza. Qui si discute la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza tutte le ottiche di commutazione nella forma di una bassa potenza ottica Kerr porta per isolare i segnali Raman e di fluorescenza. Un singolo laser 808 nm con 2,4 W di potenza media e 80 MHz, frequenza di ripetizione è diviso, con circa 200 mW di luce 808 nm di essere convertito in <5 mW luce di 404 nm inviato il campione di eccitare scattering Raman. I restanti non convertito luce 808 nm viene poi inviato ad un mezzo non lineare, dove funge da pompa per il tutto-ottica dell'otturatore. L'otturatore si apre e si chiude in 800 fs con un'efficienza di picco di circa il 5%. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza ad un tasso di ripetizione 80 MHz utilizzando energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri. Poiché il sistema non ha alcuna capacità di ricambio in termini di potenza ottica, abbiamo dettaglio diverse considerazioni di progettazione e di allineamento che aiutano nella massimizzare il throughput del sistema. Discutiamo anche nostro protocollo per ottenere la sovrapposizione spaziale e temporale del segnale e travi pompa all'interno del mezzo Kerr, nonché un protocollo dettagliato per l'acquisizione dello spettro. Infine, si segnala un paio di risultati rappresentativi degli spettri Raman ottenuti in presenza di una forte fluorescenza utilizzando il nostro tempo-gating sistema.

Protocollo

1. Alcuni bisogna fare attenzione nella preparazione e l'immissione di un campione Raman all'interno di questo sistema.

1. Poiché il sistema fa uso di solito molto alti obiettivi apertura numerica con distanze di lavoro molto brevi, i campioni sono posti su un vetrino. I campioni biologici sono generalmente posto su un vetrino n ° 1 spessore montato in una camera cellula Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Campioni liquidi, in particolare quelli tossici per l'uomo, vengono inseriti in una piccola bottiglia di vetro con un coprioggetto cementato l'apertura per mezzo di una resina di silicone. La bottiglia viene poi invertito per la misurazione.
3. Perché il nostro sistema dipende dalla tempistica precisa della pompa e gli impulsi del segnale, siamo costretti a non usare la regolazione convenzionale centro del nostro microscopio, che traduce l'obiettivo su e giù. Questa somma e sottrae percorso ottico dal nostro sistema. Invece, abbiamo posto i nostri campioni su un palco secondario montato sulla parte superiore del palco microscopio che ha un proprio controllo messa a fuoco indipendente.

2. Al fine di prendere tempo-dipendenti spettri Raman, il fascio di eccitazione deve essere adeguatamente preparato.

1. Si comincia con la luce che emerge da una W 2,4 sintonizzabile pulsata Ti: Sapph laser (Chameleon, sistemi coerenti, Santa Clara, CA). Ogni impulso del treno di impulsi 80 MHz ha 30 nj di energia, ha una larghezza temporale di 140 fs, ed ha uno spettro centrata a 808 nm con una larghezza di banda spettrale di ~ 6 nm.
2. Per evitare di back-riflessioni di rientrare nella cavità laser, la luce passa attraverso un isolatore Faraday. Un semionda piatto posto davanti l'isolatore di Faraday permette la sintonizzazione continua della potenza totale inviato nel sistema.
3. Perché 6 nm è troppo ampia larghezza di banda per risolvere i modi di trasporto più Raman, il fascio viene inviato attraverso un molto stretto (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH), filtro passa-banda centrata a 808 nm.
4. La luce è poi focalizzata da un doppietto acromatico (f = 100 mm) su un 5 millimetri β-borato di bario (BBO) cristallo (CASIX, Fuzhou, Fujian, Cina) di dimezzare la lunghezza d'onda da 808-404 nm nm. Il cristallo BBO è posto in un monte con controlli punta e inclinazione, ed anche montato su un palcoscenico di traduzione. Per massimizzare l'efficienza della conversione lunghezza d'onda, il cristallo deve essere posta esattamente simmetriche rispetto al centro del doppietto, e con il suo asse di cristallo allineato alla polarizzazione del fascio in entrata.
5. Perché l'efficienza della conversione lunghezza d'onda è la polarizzazione-dipendente, il controllo della quantità di luce inviata al campione può essere ottenuta con piazzando una seconda semionda piatto dopo l'isolatore di Faraday. Ruotando questo waveplate, l'intensità della luce inviata al campione può essere regolata in modo indipendente l'intensità del fascio trasmesso pompa (di cui parleremo più avanti).
6. La lunghezza d'onda-luce è convertita recollimated da un doppietto acromatico secondo (f = 500 mm) scelto in modo che il fascio di uscita è abbastanza grande da riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo microscopio, e diretto in un microscopio invertito (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) per mezzo di due specchi di sterzo.
7. L'obiettivo microscopio, essendo l'elemento ottico ospitato all'interno del componente più monolitica del sistema, definisce l'asse ottico. Per allineare il fascio di eccitazione a questo asse, uno specchio è inserito nel piano campione del microscopio. I due specchi di sterzo sono poi iterativamente sintonizzati osservando il back-riflesso fascio laser su un CCD cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Germania) collegato alla porta di imaging del microscopio. Supponendo che l'immagine sulla fotocamera è incentrata sul microscopio campo di vista, il raggio è in asse, quando il punto focale è centrato sul chip microscopio e la traduzione degli obiettivi lungo l'asse z non cambia il punto centrale del fascio sfocata.
8. Quando un campione è posto nel piano di campionamento e irradiati con luce laser scattering Raman si verifica. Un filtro dicroico posto sotto l'obiettivo microscopio separa la lunghezza d'onda in differita luce Raman sparsi (e fluorescenza) dal fascio di eccitazione, dirigendo la luce Raman sparsi per l'attacco laterale del microscopio. Il microscopio è stato modificato per rimuovere le lenti all'interno di questo percorso, in modo che la luce del segnale emerge dal microscopio collimato.
9. Poiché il raggio del segnale che emerge dal microscopio è più grande l'apertura chiara del Glan-Thompson polarizzatori, un telescopio 0.47x composto da due doppietti acromatici (= 75 mm f1, f2 = 35 mm) viene utilizzato per ridurre il raggio.
10. La luce del segnale viene poi polarizzato da un polarizzatore Glan-Thompson orientati a 0 ° rispetto alla verticale, nella cornice di laboratorio, e diretto a uno specchio dicroico dove viene ricombinato con il fascio di pompa.

3. Affinché il cancello ottico per operare al massimo dell'efficienza, è necessario prestare attenzione nella preparazione del fascio di pompa (Kerr fascio) pure.

L'impulso di pompa viene prima amplificata da 0.35x con un telescopio costruito con due doppietti acromatici (= 35 mm f1, f2 = 100 mm) per adattarsi alle dimensioni finali del raggio del segnale.
1. Il fascio di pompa viene poi inviato in una linea di ritardo composta da un prisma ad angolo retto posto su un palco traduzione lineare che può essere regolato per garantire la sovrapposizione temporale degli impulsi di pompa e di segnale (messa a punto da discutere più avanti).
2. Dopo la linea di ritardo, il fascio viene inviato attraverso una semionda piastra e polarizzatore orientato a 45 ° rispetto alla verticale, nella cornice di laboratorio. In questo modo il proprio stato di polarizzazione del fascio di pompa quando raggiunge il medium non lineare.
3. La luce viene poi riflessa da due specchi di sterzo, uno con piezo-elettrico di controllo, che vengono utilizzati per regolare con precisione la posizione del fascio di pompa in modo tale che si sovrappone spazialmente con il raggio del segnale. La sovrapposizione si ottiene osservando la pompa e travi di segnale in due luoghi, uno vicino e uno lontano dallo specchio dicroico in cui si combinano le travi. Usando il primo specchio di sterzo a sovrapporre i due fasci nel punto vicino, e lo specchio piezo di sovrapporre i fasci nel punto lontano, il fascio di pompa può essere fatto esattamente allineati con il raggio del segnale.
4. Con i due fasci combinati, il cancello Kerr e il sistema di raccolta sono impostati per massimizzare il tempo-dipendenti raccolti segnale.

4. Con i due fasci combinati, il cancello Kerr e il sistema di raccolta sono impostati per massimizzare il tempo-dipendenti raccolti segnale.

1. Le travi pompa e segnale vengono prima passare attraverso un filtro dicroico che ha un diametro di 6 a 404 nm per evitare qualsiasi luce residua eccitazione da emozionanti scattering Raman all'interno del mezzo non lineare.
2. La pompa e le travi del segnale sono poi entrambe focalizzate da un doppietto acromatico (f = 35 mm) in una cuvetta di 1 centimetro cammino ottico di quarzo contenente il materiale non lineare. Qualsiasi materiale non lineare con un alto indice opportunamente non lineare (superiore CS _2), opportunamente breve risposta temporale (<2 ps), possono essere utilizzati qui. Per questi esperimenti, usiamo disolfuro di carbonio, CS _2, che ha un indice non lineare n ₂ = 3.1 x 10 ^-18 m ² / W. La luce viene poi recollimated da un doppietto secondo con una lunghezza focale identico al primo.
3. Le travi sono poi passati e Glan-Thompson analizzatore su un supporto rotante, e poi attraverso una serie di filtri di assorbimento e le interferenze che combinati hanno un diametro esterno di 10 a 808 nm.
4. Infine, la luce del segnale è focalizzata da un doppietto acromatico (f = 35 mm) in un micron 50 fibra ottica multimodale, in cui è montato la fibra in una fase che permette la traduzione in x, y, z. La fibra viene poi accoppiato ad uno spettrografo di imaging commerciale con annesso CCD (SP2300i e Pixis 100B, rispettivamente, sia prodotto da Princeton Instruments, Trenton, NJ).
5. Per allineare il sistema di raccolta per massimizzare il segnale raccolto, l'analizzatore è impostato a 0 ° e un campione di toluene viene inserito nel piano di campionamento. Regolando la x, y, z e controlli del monte fibra, il segnale raccolto Raman è ottimizzato.
6. Per assicurare una corretta sovrapposizione spaziale e temporale della pompa e travi di segnale, uno specchio è inserito nel piano campione del microscopio. Il filtro di 404 nm viene rimosso dal sistema. Con l'analizzatore ruotato di 90 ° il fascio retroriflessa nm 404 è inviato nel spettrografo con l'intensità regolato in modo da non saturare la fotocamera. Con il fascio pompa spenta, l'analizzatore viene ruotato per ridurre al minimo la trasmissione del segnale nm 404. Con il fascio di pompa riaccesa, la fase di ritardo è sintonizzato lentamente fino a quando la trasmissione della luce 404 nm comincia ad aumentare. Allora, per iterativamente messa a punto la fase di ritardo, il piezoelettrico specchio, e la x, y, z e controlli della fibra, si massimizza il segnale.
7. Poiché il retro-riflessa 404 nm e il fascio di luce Raman sparsi possono prendere strade leggermente diverse attraverso il sistema, le regolazioni finali sono realizzati mettendo una forte Raman diffusore (come il toluene) sul palco del campione e la messa a punto leggermente l'allineamento cambiando il fase di ritardo, piezeo elettrici specchio e controlli x, y, z della fibra di ottimizzare il segnale Raman.

5. Raccolta di un singolo time-gated spettro Raman richiede l'acquisizione di spettri diversi per correggere gli artefatti del sistema.

1. Con l'analizzatore a 0 °, il fascio di eccitazione e la trave sulla pompa off, uno spettro "ungated" è tratto, che rappresenta lo spettro che sarebbero stati acquisiti senza il beneficio del tempo-gating sistema.
2. Con l'analizzatore impostato a 90 °, il fascio di eccitazione e il fascio di pompa ancora fuori, un back-ground spettro è presa, che rappresenta la quantità di luce parassita che cola attraverso la polarizzatori e gli altri elementi del sistema.
3. Con l'analizzatore rimanenti a 90 °e tutte le travi in ​​poi, lo spettro di "gated" è tratto, che rappresenta la luce Raman sparsi consentito attraverso i polarizzatori attraversato dalla presenza del fascio di pompa.
4. Infine, con l'analizzatore ancora a 90 °, il fascio di eccitazione fuori e il fascio di pompa, uno spettro di fondo secondo è preso, che rappresenta il contributo allo spettro di "gated" di somme residue di luce 808 nm entrare nel spettrografo.
5. Inoltre, uno spettro è presa con tutti i laser spento, che caratterizzano il livello di base "oscura" il segnale della telecamera ed elettronica.
6. Poiché gli spettri spesso richiedono lunghi tempi di integrazione, è indispensabile rompere questo tempo di integrazione in vari pezzi (fotogrammi) per consentire la correzione adeguata dei raggi cosmici - un problema comune quando l'acquisizione di dati su campate di diversi minuti.

6. Una volta acquisito, fasi di lavorazione diverse sono utili per migliorare la qualità e l'aspetto dei dati.

1. In primo luogo, tutti gli spettri sono scure corretti sottraendo al largo spettro "dark".
2. Per correggere i raggi cosmici, i diversi frame che costituisce una acquisizione sono confrontate tra di loro su un pixel-by-pixel. Per ogni pixel di ogni fotogramma che cade al di fuori di 2 deviazioni mediana dal valore medio per quel pixel su tutti i fotogrammi, valore pixel è sostituito dal valore medio su tutti i fotogrammi.
3. Le cornici dei raggi cosmici vengono poi corretti media e levigate da un Savitzky-Golay filtro ^1.
4. Per estrarre lo spettro di "vero" gated, sottraiamo il "eccitazione-only" e "pompa-only" spettri dallo spettro misurato gated.
5. Infine, gli spettri gated e ungated sono poi di fondo corretta sottraendo una 5 ^° ordine polinomiale, determinato con il metodo di Lieber e Mahadevan-Jansen ^2.

7. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Schema del sistema di gating Kerr. Il percorso del fascio pompa è mostrato in rosso, mentre il percorso SHG è mostrata in blu. Il percorso in cui si sovrappongono Raman e di fluorescenza viene evidenziato in verde, mentre il percorso in cui la fluorescenza è stata temporalmente filtrati è evidenziata in giallo. Abbreviazioni come segue: BPF, filtro passa banda, CCD, Charge-Coupled Device, DCM, specchio dicroico, FI, Faraday isolatore; λ / 2, onda piastra metà, LPF, filtro passa-tempo; NLM, non lineare media; P, polarizzatore ; SHG, cristallo generazione di seconda armonica.

Figura 2 Top:. Spettri gregge di cumarina disciolto in olio di immersione. Curva rossa mostra lo spettro prese con la porta tenuta aperta (analizzatore impostato per la massima trasmissione). Curva nera mostra lo spettro preso con l'analizzatore in linea per la trasmissione minima ed una pompa applicata fascio (lo spettro gated). Curva blu mostra l'spectum prese con l'analizzatore in linea per la trasmissione minimo e nessuna pompa fascio applicato (porta tenuta chiusa). Curva verde mostra lo spettro presa solo con il fascio di pompa applicata. Linee tratteggiate indicano magenta regione spettrale mostrata nel pannello in basso. Tutti gli spettri sono stati smussati con una punto 11, 3 ° ordine Savitzky-Golay filtro. In basso: spettri di cumarina disciolto in olio di immersione dopo fluorescenza di fondo sottrazione. Curva rossa è lo spettro con la porta tenuta aperta, e la curva blu è lo spettro gated. Lo spettro gated mostra chiaramente il contorto alto numero d'onda caratteristica di punta di oli.

Discussione

Il campo della ricerca biomedica spettroscopia Raman ha visto un crescente interesse negli ultimi anni come risultato del suo potenziale dimostrata per risolvere diverse sfide difficili nella diagnostica biologica. Per esempio, spettri Raman hanno dimostrato di avere valore diagnostico nel cancro della rilevazione ^{3, 4, 5, 6.} Spettroscopia Raman è stata utilizzata anche nella quantificazione batterica ^{7, 8} e risposta ai farmaci dei batteri ^9. Inoltre ha trovato applicazione in una vasta ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lenti	Thorlabs	Vari	Tutte le lenti rivestiti di avere perdite di trasmissione massima di 1% ciascuno
Ti sintonizzabile: Sapph laser	Coerente	Camaleonte	NJ 30, 200 fs, 80 MHz
40X olio obiettivo ad immersione	Olimpo	UApo/340	NA = 1,35
Microscopio invertito	Olimpo	IX-71	Modificato per rimuovere tutti gli obiettivi a babordo
Mezza onda piastra	Thorlabs	AHWP05M-600
Glan-Thompson polarizzatore	Thorlabs	GTH10M	~ Perdita di trasmissione del 10%
Spettrometro	PI Acton	SP2300i
CCD	PI Acton	Pixis 100B
Software Mathmatical	The MathWorks	MATLAB	versione 2008a
Faraday isolatore	EOT	BB8-5I
Piezoelettrico specchio	Newport	AG-M100
BBO cristallo	CASIX	costume	1 millimetro di spessore
Passabanda filtro 1	Andover	008FC14	808 ± 0,4 nm
Specchio dicroico	Semrock	FF662-FDI01	limite di banda a 662 nm
Lungo filtro passa-	Semrock	BLP01-405R	limite di banda a 417 nm
Passabanda filtro 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS 2	Sigma-Aldrich	335266	99% di purezza
Cumarina 30	Sigma-Aldrich	546127	99% di purezza
Olio di immersione	Cargille	16242	Tipo di DF