Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo. In vivo Analisi dello sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo a livello clonale può essere raggiunto in questo modo.
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Articolo metodologico
Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Schemi precisi di divisione, migrazione e differenziazione delle cellule progenitrici neurali sono cruciali per il corretto sviluppo del cervello e 1,2 funzione. Per capire il comportamento delle cellule progenitrici neurali nel complesso in un ambiente vivo, time-lapse immagini dal vivo delle cellule progenitrici neurali in un cervello intatto è criticamente necessaria. In questo video, sfruttiamo le caratteristiche uniche di embrioni di zebrafish per visualizzare lo sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo in vivo. Noi usiamo per elettroporazione geneticamente e scarsamente etichetta singole cellule progenitrici neurali. In breve, il DNA che codifica per i costrutti marcatori fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo proencefalo di 22 ore dopo la fecondazione (HPF) embrioni di zebrafish e impulsi elettrici sono stati consegnati immediatamente. Sei ore più tardi, gli embrioni di zebrafish elettroporate sono stati montati con agarosio a basso punto di fusione in fondo la cultura piatti di vetro. Fluorescente cellule progenitrici neurali sono state poi ripreso per 36 ore con intervalli fissi al microscopio confocale utilizzando lenti dell'obiettivo acqua immersione. L'attuale metodo fornisce un modo per acquisire conoscenze nel vivo nello sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo e può essere applicato ad altre parti del sistema nervoso centrale dell'embrione zebrafish.
Protocollo
1. Preparazione di embrioni di zebrafish
- Due giorni prima elettroporazione, istituito gabbie di accoppiamento dei pesci di tipo selvatico con divisori per separare i maschi dalle femmine.
- Un giorno prima elettroporazione, tirare i divisori in accoppiamento gabbie a partire dal giorno precedente.
- Raccogliere embrioni e incubare 50 embrioni fecondati in 30 ml di mezzo embrionale contenente 0,003% phenylthiourea (PTU) a 28.5 ° C.
- Il giorno della elettroporazione, dechorionate gli embrioni manualmente con una pinza sottile (Inox 5, Dumont elettronico, Svizzera), quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo di 22hpf. Poi i....
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Discussione
In questo video, si dimostra un metodo per time-lapse immagini dal vivo di cellule progenitrici neurali a livello clonale nel proencefalo zebrafish via di sviluppo. Abbiamo testato e modificato i protocolli esistenti elettroporazione 4-6 a geneticamente e fluorescente etichetta singole cellule progenitrici neurali. Un albero lignaggio composto da cellule progenie clonale relativi possono essere stabiliti dal momento che solo poche cellule sono state scarsamente etichettati con un voltaggio relativamente basso.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da theNIH grantNS042626. Ringraziamo Thorn Kurt e UCSF Nikon Imaging centro per l'assistenza con l'imaging.
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Riferimenti
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V.
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Ristampe e permessi
