Misurare Coordinamento motore in Mouse

Sommario

Protocolli sono presentati per due compiti stabiliti coordinazione motoria, il bar rotarod e orizzontali di accelerazione, anche due test sviluppati in Oxford di recente, le barre statiche e barre parallele. Questi test in grado di rilevare deficit motori potenzialmente di interesse in sé, oltre ad essere possibili variabili in prove di altre aree del comportamento.

Abstract

I topi sono sempre più utilizzati in neuroscienze comportamentali, in gran parte sostituendo i ratti come animali del comportamentista di scelta. Prima che possono essere valutati gli aspetti del comportamento, come emotività o cognizione, tuttavia, è di vitale importanza per determinare se le capacità motorie di esempio un topo mutante o lesionato consentire tale valutazione. Prestazioni su un labirinto compito che richiede forza e di coordinamento, come ad esempio il labirinto ad acqua di Morris, potrebbe anche essere compromessa in un mouse dal motore, piuttosto che cognitivo, disturbi, quindi è essenziale per analizzare selettivamente il secondo dal primo. Ad esempio, sensomotorio menomazioni causate da antagonisti NMDA hanno dimostrato di alterare le prestazioni acqua labirinto ^2.

Coordinazione motoria si valuta tradizionalmente in topi e ratti dal test rotarod, in cui l'animale è posto su una barra orizzontale che ruota attorno al suo asse longitudinale; l'animale deve percorrere avanti per rimanere in posizione verticale e non cadere.Sia la velocità impostata e versioni accelerazione di rotarod sono disponibili.

Gli altri tre test descritti in questo articolo (barra orizzontale, aste statiche e parallele) ogni misura coordinamento apparato statico. La barra orizzontale richiede anche forza per prestazioni adeguate, in particolare degli arti anteriori come il mouse inizialmente prese il bar solo con le zampe anteriori.

Ratti adulti non si comportano bene nei test, come le barre statiche e barre parallele (osservazioni personali), ma appaiono meno ben coordinate rispetto ai topi. Ho testato solo ratti maschi, tuttavia, e topi maschi sembrano generalmente meno coordinato bene rispetto alle femmine. I topi sembrano avere una forza superiore: rapporto peso rispetto ai ratti, il nome latino, Mus musculus, sembra del tutto appropriato. Rotarod, le variazioni del test di contatto piede ¹² o il (Noldus) ¹⁵ Apparecchiatura Passerella sono generalmente utilizzati per valutare coordinazione motoria in ratti.

Introduzione

Comportamento si manifesta con l'azione, e l'azione richiede abilità motorie, compreso il coordinamento del corpo. Uno dei primi esperimenti della storia del comportamento animale è stata eseguita da Colin Stewart, uno studente di dottorato alla Clark University negli Stati Uniti ^11. Ha misurato l'attività di ratti mettendoli in un tamburo e contato il numero di volte che si è scoperto. Questo apparato iniziale era probabilmente il precursore di esecuzione ruote e la prova rotarod attualmente utilizzati, sebbene nella apparecchiatura Stewart il topo era all'interno del tamburo, il cui movimento trainato dal ratto, mentre nel rotarod l'animale cammina all'esterno un tamburo rotante o di canna, che è motorizzata.

L'asta originale usato da Dunham e Miya (1957) ⁷ ha avuto una velocità impostata, ma le versioni oggi accelerazione (Jones e Roberts 1968) ⁹ sono disponibili. Lo svantaggio di un rotarod velocità impostata è che alcuni animali con scarsa coordinazione cadranno al'inizio, mentre per coloro che soggiornano in poi, il test inizierà presto a misurare la resistenza piuttosto che dal coordinamento per sé. La risultante distribuzione bimodale dei punti di dati può essere sufficientemente anormali da precludere l'analisi parametrica. Quando viene utilizzato un rotarod accelerazione, specialmente se viene accelerato solo quando un criterio insieme, come rimanere acceso per 10 sec, viene raggiunto, la distribuzione dei dati è più probabile che sia gaussiana. Il tasso di accelerazione può essere regolata in modo che la fatica del motore non gioca un ruolo significativo nelle prestazioni, un mouse è improbabile che possa subire affaticato dopo appena 2-3 minuti di tempo sul rotarod.

Il "test del nastro" ^1, "test gruccia" o barra orizzontale misura la forza degli arti anteriori e coordinamento. I due epiteti indicati si riferiscono al suo sviluppo; originariamente è stato utilizzato una stringa, ma gli autori hanno notato che le prestazioni dipendeva molto da come tesa la corda è stata, quindi, sperimentatori future usato una barra di metallo, spesso una gruccia. Abbiamo trovato che la capacità di un mouse per afferrare la barra è inversamente proporzionale al suo diametro, e hanno in standard utilizzato da 2 mm bar. Nel test pesi (vedi protocollo Giove "Misurare la forza del topo") il finissimo filo di una pelliccia / scala collezionista bollitore permette agli animali più forti per garantire una buona presa tale da poter sollevare più di loro proprio peso corporeo. Tuttavia, utilizzando grandi barre orizzontali diametro può essere un vantaggio in quanto migliora la sensibilità del test, con solo un bar 2 mm più normali C57BL / 6 topi raggiungono prestazioni soffitto. Quindi abbiamo recentemente adottato un apparato di tre bar, le barre possono essere facilmente scambiati come si inseriscono nel tacche tagliate le cime delle colonne di sostegno. Le barre sono tenute sotto tensione (particolarmente importante per rendere la barra 2 millimetri rigida), si inseriscono le tacche solo quando i supporti sono leggermente disegnati insieme (come un arco lungo e la relativa stringa) (vedi Figura 3).

Aste statiche o travi sono stati spesso utilizzatiper misurare il coordinamento, ma la motivazione supplementare è stato sempre usato per convincere gli animali a percorrere l'asta. Hanno negoziato una trave orizzontale per raggiungere un obiettivo desiderato, come ad esempio la gabbia a casa, rifugio da una luce brillante, o cibo (se è stato fatto affamati). Tuttavia, nel corso delle indagini su questo tipo di test, ho scoperto che i topi si trasformerebbe spontaneamente in giro quando sono immessi sul finale "aperto" di una canna a sbalzo, e poi attraversarlo fino a raggiungere la fine supportato. Questa tecnica elimina la necessità di formazione (necessaria nelle varianti di test precedentemente citati) come la reazione innata di un mouse per se posizionato vicino all'estremità di un'asta elevata è tentare di raggiungere la fine supportato. Questo non significa, naturalmente, eliminare il problema che i cambiamenti motivazionali potrebbero influire sulle prestazioni, che è sempre una possibilità di questo tipo di procedura.

Tunnel di cartone sono attualmente molto usato per la casa gabbia arricchimento ambientale, ma il loro svantaggivantaggio nel contesto attuale è che gli animali saranno inevitabilmente essere praticate in equilibrio su cilindri che può traballare sul loro asse lungo, mimando le competenze necessarie per bilanciare il rotarod. Così a casa gabbia arricchimento potrebbe potenzialmente mascherare un fenotipo comportamentale, un esempio è di un miglioramento di Huntington malattia fenotipo di arricchimento ^14. Anche gli animali spesso a piedi lungo l'asse di questi tunnel, come quando si cammina lungo un fascio statico elevato. Quindi ho costruito un paio di elevate barre parallele, e messo i topi in mezzo con le zampe anteriori su una barra e le hindpaws dall'altro, una situazione che non avrebbero mai incontrato prima. Topi avevano per raggiungere la fine supporti delle barre parallele rimanendo in posizione verticale per superare la prova. Un dispositivo in qualche modo simile fu una serie di barre parallele poste in una gabbia del mouse per valutare lo sviluppo di scrapie indotta motore disfunzione ^13.

Ora abbiamo testato diverse centinaiamouse per il funzionamento del motore a Oxford. Questi aveva ricevuto vari trattamenti tra cui agenti farmacologici, o il trasferimento passivo di tessuto (plasma) da esseri umani, ma soprattutto gli animali geneticamente modificati. Alcuni animali sono stati più compromesse in forza di compiti di coordinamento, altri viceversa. Alcuni topi sono stati più compromessa sul rotarod che su supporti statici come le aste statiche e barre parallele, altri viceversa. Così il presente articolo e il protocollo JOVE accompagnamento "forza di misura nei topi") descrivono come caratterizzare il modo in diversi trattamenti e le mutazioni possono influire in modo differenziale la funzione motoria nei topi. A parte il rotarod l'apparecchiatura descritta qui è semplice, economico e particolarmente adatta per i laboratori non specializzati per testare le capacità motorie. Per l'analisi del cammino scala fine, il sistema Catwalk è un sistema molto più sofisticato rispetto ai metodi più vecchi come persuadere un mouse per camminare attraverso un bagno di inchiostro e poi giù un pezzo di carta, ma è un expensive la apparecchiature.

Tutti questi test sono progettati per misurare il coordinamento piuttosto che la forza, anche se ovviamente un grado minimo di tono muscolare è necessaria solo per il mouse per usare le sue arti. Per la valutazione, la procedura schermata invertita ¹⁰ è più adatto, oppure, se è richiesta una misurazione più graduale, il test pesi o la sua automatizzato bar-pull equivalente (descritto in JoVE protocollo "forza di misura in mouse"). L'eccezione è il test barra orizzontale, che richiede sia la forza e la coordinazione per prestazioni di successo.

Protocollo

1. Apparato

Per tutte le prove, una superficie morbida imbottita è posto alla base dell'apparecchio per attutire eventuali topi che cadono. NB Questo non è mostrata nelle figure, per non oscurare qualsiasi parte dell'apparato. Durante il test di centinaia di topi, sia normale e mutante, non abbiamo mai osservato alcun danno causato dalla caduta di tale apparecchio, che in genere è alto 30-50 cm. Inoltre, assicurarsi di pulire e sterilizzare le attrezzature tra un topo testati.

1.1 Rotarod

Ci sono diverse versioni commerciali di questo apparecchio sul mercato, ma alcuni hanno degli svantaggi, come ad esempio in mancanza di accelerare a una velocità adeguata per rilevare incoordinazione motoria (piuttosto che di resistenza). Un altro errore comune è che l'asta non è abbastanza alta sopra la base, con conseguente topi tendono a cadere o saltare.

Rotarod mostrato in Figura 1 è stato fatto per la progettazionedell'autore dalle sezioni di ingegneria del dipartimento di Farmacologia, Università di Oxford. L'asta è di 3 cm di diametro, supportati 30 cm sopra la base dell'apparato. La superficie è zigrinata in una serie di creste parallele lungo l'asse longitudinale, permettendo ai topi di afferrare in modo efficace (Figura 2). NB La profondità delle nervature è un dettaglio vitale, se il mouse non può avere una buona presa del test sarà molto più difficile, d'altra parte, se la presa è troppo buono il mouse "cartwheel" intorno all'asta tenendo passivamente su di esso. Per i "creatori rotarod dilettanti", può essere utile sapere che zigrinata Sagomatura di legno di dimensioni adeguate per i topi è disponibile in commercio, ma sarebbe ovviamente bisogno di essere trattati con una buona vernice impermeabile prima dell'uso. La velocità iniziale viene regolata a 4 rpm, la velocità di accelerazione a 20 giri / min. La velocità massima è di 40 giri al minuto.

Due flange impedire il mouse di lasciare l'asta. Essi sono 30 cm di diametro (questapotrebbe probabilmente essere ridotta a 20 cm). La loro separazione è fissato a 6 cm (massimo), ma potrebbe essere necessario un aggiustamento più piccola per topi subadulti se tendono a girarsi sulla canna.

1.2 barre orizzontali triple (Figura 3)

Le barre sono in ottone, lunga 38 cm, partecipata al 49 cm sopra la superficie del banco da una colonna di supporto in legno a ciascuna estremità. Le colonne sono fissati ad una base di legno pesante. Tre diametri di barra sono disponibili: 2, 4 e 6 mm. Il bar mm 2 è quello standard che usiamo, ma molti topi raggiungono punteggi massimi su questo. Pertanto più grandi barre di diametro sono stati inclusi nel tentativo di perfezionare la prova, come i topi non possono afferrare queste così bene.

1.3 aste statiche

Cinque tasselli di legno o tondini di spessore variabile (35 (asta 1), 28, 22, 15 e 9 (asta 5) mm di diametro) ogni 60 cm di lunghezza sono fissati da un G-clamp per una mensola laboratorio tale che le aste sporgono orizzontalmente nello spazio (Figura 4). Finedella canna vicino al banco ha un segno 10 cm dalla fine, per indicare la linea di arrivo. L'altezza delle aste dal pavimento è di 60 cm.

Se è richiesta una prova più breve e meno dettagliata, utilizzare solo i più grandi aste, piccole e medie. Van Dellen et al. ¹⁴ usato solo una sola asta per valutare lo stato di avanzamento della malattia di Huntington in topi.

1.4 Parallele

Due barre di acciaio paralleli 1 m di lunghezza e 4 mm di diametro sono fissi 30 mm (sul loro centri) a parte da colonne di sostegno in legno alle estremità (Figura 5). Le barre sono 60 cm dal pavimento.

2. Procedura

Per tutti i test, i topi portano alla sala sperimentale 5-20 minuti prima del test, per assicurare che siano completamente sveglio. Come regola generale, per consentire il recupero della forza muscolare e di un ritorno ai normali livelli di eccitazione, riposare i topi da un ritorno alla gabbia a casa dopo ogni prova del motore.

2.1 Rotarod

Impostare la rotarod con una velocità iniziale di 4 giri, velocità di accelerazione 20 giri / min. Tenendo premuto il mouse per la coda, e posizionarlo sulla canna rotante, rivolta verso il senso di rotazione in modo che abbia a camminare in avanti per rimanere in piedi. Questo è più facile da fare se il mouse viene portata verso l'asta ad un angolo di 45 ° sotto l'orizzontale; tentativo di abbassare il mouse da sopra comporterà una sua diffusione zampe posteriori e afferrare i bordi delle flange. Rilasciare rapidamente il mouse quando si è quasi a toccare l'asta, appena di andata e sopra le aste morto superiore, le consente di afferrare facilmente l'asta. Una tecnica (probabilmente più semplice e più affidabile) è di usare un sottile (10-15 mm) tassello. Tenendo premuto il mouse in una mano, abbassarlo al tassello, parallela all'asse lungo. Il tassello è angolato con la testa verso il basso del topo di circa 30 ° per dare più tempo per afferrare il rotarod una volta che viene rilasciato. Abbassare il mouse e tassello tra the flange del rotarod, e una volta sopra l'asta rotante il tassello verso il basso tirare lontano dal mouse, che afferrare il bastone e camminare in avanti.

Al 10 sec dopo aver posizionato il mouse sulla barra, avviare l'accelerazione (a condizione che il mouse sia rivolto in avanti: in caso contrario, attendere fino a che non faccia in avanti prima di iniziare l'accelerazione), e notare la velocità con cui il mouse si stacca. Se cade prima di 10 secondi, annotare il tempo di caduta e riprovare, fino a tre volte in totale, registrando la velocità alla prima caduta, dopo il punto 10 sec. Tuttavia, cade prima di 5 secondi, che sono causa di scarsa immissione dallo sperimentatore non devono essere registrati. La velocità media di caduta è il dato, piuttosto che utilizzare la velocità massima, questo corregge per la pratica in più il mouse riceve durante le corse non completati, che si presume possa essere utile alla performance. Così un topo che cade prima di 10 secondi, una volta poi rimane accesa fino a 12 giri al secondo punteggi di tempo (4 +12) / 2 = 8 giri. Un mouse che cade due volte poistare su per 10 giri punteggi (4 +4 +10) / 3 = 6 giri. Se il mouse non riesce a presa in 10 sec tre volte assegnano un punteggio di 4 giri.

Un problema è che i topi a volte smettono di camminare in avanti e afferrare saldamente l'asta, invece, in modo che essi passivamente capriola rotonda, anche se la maggior parte alla fine cadere. Potrebbe quindi essere utile notare anche la velocità quando si verifica il primo tale inversione. Una possibile soluzione potrebbe essere quella di utilizzare un'asta di diametro maggiore o creste meno pronunciate.

2.2 barre orizzontali

Come topi trovano più facile cogliere la stretta mm 2 bar, si consiglia di provarli prima su questo. Tenendo premuto il mouse per la coda, posizionarlo sulla panchina di fronte dell'apparecchio, farlo scorrere rapidamente all'indietro di circa 20 cm (questo si allinea perpendicolare al bar), sollevare rapidamente e farlo afferrare la barra orizzontale in corrispondenza del punto centrale con le zampe anteriori solo, e rilasciare la coda, che iniziano contemporaneamente il cronometro. Questo cun essere difficile da raggiungere in modo efficiente; alcuni topi migliore presa se la coda viene rilasciato improvvisamente, se si sentono sono ancora supportati possono non riuscire a grip. Il punto criterio è o una caduta dal bar prima che il mouse raggiunge una delle colonne terminali della barra, o il tempo finchè uno zampa tocca una colonna. Tempo massimo di prova (cut-off time) è di 30 sec.

Se il mouse non riesce a cogliere la barra correttamente prima volta e questo sembra essere attribuibile alla tecnica dello sperimentatore, invece del mouse, provare di nuovo (dopo un breve riposo, mentre un altro uno o due topi sono testati) e di non registrare questo autunno. Se il mouse cade prima 5 sec e questo non è apparentemente dovuto alla scarsa immissione dallo sperimentatore, ripetere fino a tre volte nel tentativo di ottenere una> 5 sec punteggio. Se> 5 sec al secondo tentativo, non fare una terza prova. Prendete il miglior punteggio come il dato. Un mouse che non riesce più volte a sostenere se stessa per> 5 sec punteggi solo 1.

Se si utilizza la versione a tre bar, se segna il topo 5 su questa prima mm barra 2 può quindi essere testato su barre più spesse, dopo un breve periodo di riposo, mentre un altro uno o due topi sono testati. Il sistema di punteggio per le barre 4 mm e 6 è la stessa che per la barra 2 mm, e il punteggio finale è il totale cumulata. Così un topo che i punteggi 5 sulla barra 2 millimetri ma cade dalla barra mm 4 dopo 13 sec punteggi 5 +3 = 8.

2.2.1

Segnando le barre orizzontali: i primi due valori sono inferiori gli ultimi due come una volta che i topi hanno inizialmente dominato il compito che sono meno probabilità di cadere:
Caduta tra 1-5 sec = 1
Caduta tra 6-10 sec = 2
Caduta tra 11-20 sec = 3
Caduta tra 21-30 sec = 4
Caduta dopo 30 sec = 5
Mettendo una zampa su un supporto barra senza cadere = 5

NB l'uso opzionale di 4 e 6 bar mm è una nuova aggiunta al nostro protocollo non abbiamo ancora la vastaesperienza con loro.

2.3 aste statiche

Posizionare il mouse in fondo della più ampia dell'asta (lunghezza punta del naso di testa uno dalla fine è l'ideale). Adottare due misure: tempo di orientamento (tempo impiegato per orientare 180 ° rispetto alla posizione iniziale verso il ripiano) e il tempo di transito (il tempo impiegato a percorrere al fine mensola (naso oltre la tacca 10 cm dall'estremità scaffale dell'asta).

Orientamento dipende dal topo rimanere in posizione verticale, se gira capovolta e si aggrappa al di sotto della barra, arbitrariamente assegnare (a fini statistici) il punteggio massimo orientamento di 120 sec. Non testarlo su aste più piccole, anche il tempo di transito diventa il valore massimo come un mouse che transita in posizione verticale è ovviamente meglio coordinata di uno che transita mentre appeso a testa in giù.

Se, dopo l'orientamento, il mouse cade o si raggiunge il tempo massimo di prova (arbitrariamente fissato a 120 sec) non provarla su saste maller. A fini statistici, i topi assegnano discesa vengono assegnati 120 per quella particolare asta e per le successive, poiché si presuppone che avrebbero nuovamente cadere da un asta stretto. Se il mouse si trasforma a testa in giù, si noti anche questo evento, per il transito di successo così come l'orientamento deve rimanere in posizione verticale sulla canna. In caso contrario, assegnare il punteggio massimo. Rimuovere il mouse dopo che raggiunge l'estremità dell'asta o cadute.

Dopo la prova su una canna di restituire il mouse per la gabbia a casa a riposare, mentre si prova un altro mouse. Poi metterlo sulla prossima asta di dimensioni più piccole e testarlo nello stesso modo nuovo. Interrompere le prove se il mouse cade una canna dopo essere stato su di esso per più di 5 sec. Se è caduto in meno di 5 sec sostituirlo e lasciarlo un altro tentativo (come rientrante in 5 secondi potrebbe essere dovuto alla immissione errata dallo sperimentatore), per un massimo di tre prove, e utilizzare il miglior risultato.

2.4 Parallele

Posizionare il mouse in tegli centro delle due barre con il proprio asse longitudinale ortogonale a quello delle barre; entrambe le zampe anteriori dovrebbero essere su una barra, entrambe le zampe posteriori su l'altra barra. Scoring è simile a quello per le aste statiche. Adottare due misure: il tempo impiegato fino orienta il mouse 90 ° nella posizione iniziale, e il tempo fino a raggiungere di conseguenza una delle estremità supporti. Se il mouse si trasforma a testa in giù, si noti anche questo evento. Per quanto riguarda le aste di prova statica, di orientamento e di transito devono essere raggiunti senza che girare a testa in giù, altrimenti il ​​tempo massimo è assegnato. È raro che i topi ragionevolmente sane a cadere in meno di 5 secondi, se questo dovesse accadere è probabilmente a causa della scarsa immissione. Pertanto scartare il risultato e testare nuovamente il mouse.

Risultati

Risultati attesi

Una canna statico è stato originariamente utilizzato per monitorare l'andamento della malattia di Huntington in topi mutanti, con o senza arricchimento ambientale nelle loro gabbie a casa ^14. Il programma di arricchimento ritardato drasticamente l'insorgenza di disfunzione motoria sull'asta, che è stata pari passo con un ritardo nella comparsa della zampa posteriore stringendo, segno generale di danno neurologico.

Topi scrapie-infettati hanno mostrato un calo di prestazioni barra orizzontale da 16 settimane dopo l'iniezione, nei test rotarod dalla settimana 18, e aste statiche da almeno settimana 19 ⁸ (test precedente non è stata effettuata). KATP canale subunità Kir6.2 topi KO hanno perso di valore sulle aste statiche e la barra orizzontale, ma non sul ​​rotarod ^4. Lesioni dell'ippocampo hanno avuto alcun effetto su qualsiasi misura di capacità del motore ^5, ma 129S2/Sv topi sono stati alterati rispetto alla C57BL / 6 ceppo sulle aste rotarod e statica ^3. C57BL/10 topi avevano anche le prestazioni peggiori motore di topi C57BL / 6 ^6, anche se non nella stessa misura come 129S2/Sv topi.

Figura 1. Rotarod.

Figura 2. Particolare dell'asta zigrinato della rotarod.

Figura 3. Le barre orizzontali triple Il bar tenutosi a tacche è la base due millimetri; uno. Virato sotto di esso (a scopo dimostrativo) sono le barre di 4 e 6 mm. In pratica, solo un bar in un momento è innestata nei supporti dentellati.

Figura 4. Un topo attraversa una canna statica.

Figura 5. Un mouse sulle barre parallele. Imbottitura è stata omessa solo a scopo dimostrativo.