Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Sommario

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente strumento per identificare le proteine: interazioni della cromatina che avvengono nel contesto delle cellule viventi ^1-3. Questa tecnica è stata ampiamente sfruttato nelle cellule colture di tessuti, e in misura minore, nel tessuto primario. L'applicazione di ChIP al tessuto embrionale di roditori, soprattutto nei momenti iniziali dello sviluppo, è complicata dalla limitata quantità di tessuto e l'eterogeneità dei tipi di cellule e tessuti nell'embrione. Qui vi presentiamo un metodo per eseguire ChIP con una giornata dissociata embrionale 8,5 (E8.5) degli embrioni. Cromatina tosata da un unico embrione E8.5 possono essere suddivisi in fino a cinque aliquote, che permette di materiale sufficiente l'investigatore per i controlli e per lo studio di proteine ​​specifiche: le interazioni della cromatina.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per iniziare a documentare proteine: interazioni della cromatina durante la specificazione dei programmi di geni tessuto-specifica espressione. L'eterogeneità dei tipi di cellule in un embrione limita necessariamente l'applicazione di questa tecnica perché il risultato è l'individuazione di proteine: interazioni della cromatina senza distinguere se le interazioni avvengono in tutto, un sottoinsieme di, o un tipo di cellula (s). Tuttavia, l'esame dei geni tessuto-specifici durante o dopo la comparsa di tessuto-specifica dell'espressione genica è fattibile per due motivi. In primo luogo, immunoprecipitazione di fattori specifici del tessuto isola necessariamente cromatina dal tipo di cellula in cui si esprime il fattore. In secondo luogo, immunoprecipitazione di coattivatori e istoni contenente modificazioni post-traduzionali che sono associati con l'attivazione del gene deve essere trovata solo a geni e sequenze regolatrici del tipo di cellula in cui il gene è o è stato attivato. La tecnica dovrebbe essere applicabile allo studio degli eventi più geni tessuto-specifici di attivazione.

Nell'esempio descritto di seguito, abbiamo utilizzato embrioni di topo E8.5 e E9.5 per esaminare fattore vincolante ad un muscolo scheletrico promotore del gene specifico. Somiti, che sono i tessuti precursore da cui i muscoli scheletrici del tronco e degli arti si formano, sono presenti E8.5-9.5 ^4,5. Myogenin è un fattore normativo necessario per la differenziazione del muscolo scheletrico ^6-9. I dati dimostrano che miogenina è associato proprio promotore di E8.5 e E9.5 embrioni. Perché miogenina è espresso solo in somiti in questa fase di sviluppo ^6,10, i dati indicano che le interazioni con miogenina proprio promotore si sono già verificati nelle cellule precursori del muscolo scheletrico in E8.5 embrioni.

Protocollo

1. Isolamento di embrioni

Nota: tutte le operazioni che coinvolgono i topi devono essere eseguite conformemente alla cura degli animali appropriati e politiche di utilizzo e protocolli

1. Verificare la presenza di una spina di accoppiamento nel topo femmina la mattina dopo l'accoppiamento e separare le femmine accoppiate dalla stalloni mettendoli in una gabbia diversa. Mezzogiorno del giorno che la spina di accoppiamento è osservato è considerato giorno embrionale 0,5 (E0.5) dello sviluppo.
2. A E8.5, (o la fase desiderata, se diversa), il sacrificio il mouse utilizzando un protocollo approvato.

Discussione

Nel protocollo ChIP descritto, ci mostrano che la miogenina regolatore miogenico è associato con il promotore miogenina nel tessuto muscolare scheletrico precursore presenti nel singolo E8.5 ed embrioni E9.5. Precedenti studi hanno ampiamente caratterizzato miogenina vincolante alla casella E contenenti sequenze, a partire dalla iniziale esperimenti in vitro spostamento gel utilizzando in vitro tradotto o batteri prodotto DNA radiomarcato miogenina e codifica la quota di competenza di sequenze geniche .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per saggio ChIP	Upstate, Millipore	17-295
Collagenasi di Tipo II	Invitrogen	17101015	Diluizione con PBS 1x
Dulbecco’mezzo minimo essenziale di Dulbecco (DMEM)	GIBCO, di Life Technologies	12100-061	Elevato contenuto di glucosio
Dulbecco’s soluzione salina fosfato tamponata 1X (DPBS)	GIBCO, di Life Technologies	14190-144	Privi di cloruro di calcio, privi di cloruro di magnesio
Siero fetale bovino (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Kit per l'estrazione da gel	QIAquick	28704	kit da 50 reazioni
Soluzione madre di penicillina/streptomicina	GIBCO, di Life Technologies		5000 μconcentrazione in g/ml
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich	P8340
DNA di sperma di salmone/agarosio Protein A	EMD Millipore	16-157
anticorpo anti-miogenina	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
IgG di coniglio normale	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR master mix	Promega Corp.	A6001