Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

Sommario

Il protocollo seguente delinea il processo di isolamento, ventilazione e strumentazione polmoni del mouse su misura stabile o pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni al fine di quantificare gli effetti del flusso sanguigno, flusso d'aria, i cambiamenti delle vie aeree e sui cambiamenti vascolari post-carico del ventricolo destro.

Abstract

L'isolato, ventilato e strumentato preparazione polmone del mouse permette di costante e pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni deve essere misurata con un controllo indipendente sulla portata polmonare arteriosa, frequenza delle forme d'onda di flusso, pressione delle vie aeree e la pressione atriale sinistra. Resistenza vascolare polmonare è calcolata in base multi-punto, la pressione costante flusso di curve; impedenza vascolare polmonare viene calcolata la pressione del flusso pulsatile curve ottenute in una gamma di frequenze. Come ormai riconosciuto clinicamente, l'impedenza è una misura superiore del post-carico del ventricolo destro di resistenza in quanto include gli effetti della compliance vascolare, che non sono trascurabili, soprattutto nella circolazione polmonare. Tre parametri importanti di impedenza - zero hertz impedenza Z _0, la caratteristica di impedenza Z _C, e l'indice di riflessione delle onde R _W - fornire una conoscenza distale delle arterie sezione trasversale a disposizione per il flusso, prossimale rigidità arteriosa e l'impedenza a monte ea valle mancata corrispondenza, rispettivamente. Tutti i risultati ottenuti in isolato, ventilato e polmoni perfusi sono indipendenti dal tono simpatico del sistema nervoso, lo stato del volume e gli effetti dell'anestesia. Abbiamo usato questa tecnica per quantificare l'impatto di embolia polmonare e l'ipossia cronica sulla resistenza e impedenza, e di distinguere tra i siti di azione (cioè, prossimale distale rispetto) di agenti vasoattivi e le malattie usando la dipendenza della pressione di Z _C. Inoltre, quando queste tecniche sono utilizzate con i polmoni di ceppi di topi geneticamente modificati, gli effetti a livello molecolare dei difetti vascolari polmonari struttura e la funzione può essere determinato.

Protocollo

In questo protocollo dimostriamo un caso isolato, ventilato, perfusi preparazione del polmone del mouse che in precedenza è stato utilizzato per quantificare l'impatto di embolia polmonare e l'ipossia cronica pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni (Tuchscherer, Webster e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). In breve, i polmoni del mouse sono chirurgicamente isolato nei tessuti circostanti, posto in una camera riscaldata (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilato (ventilatoria Modulo di controllo (VCM)-R con modulo timer di conteggio (TCM); Harvard gli apparecchi). La vascolarizzazione del polmone è perfuso con RPMI 1640 riscaldato mezzo di coltura cellulare con il 3,5% Ficoll utilizzando una pompa a siringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) per generare il costante flusso di forme d'onda o una pompa ad alta frequenza oscillatoria (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN), in parallelo con la pompa a siringa per creare forme d'onda pulsatile del flusso vascolare polmonare. Trasduttori di pressione (P75, Harvard Apparatus), misurare la pressione istantanea arteriosa polmonare (PAP) e la pressione atriale sinistra (LAP). Portata istantanea (Q) è misurata con un filtro in linea flussometro (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsatile della pressione del flusso rapporti sono derivati ​​da queste misurazioni, che forniscono informazioni sulle vascolare polmonare fisiologia e patologia e post-carico del ventricolo destro.

1. Attrezzatura:

1. Polmone isolato di set-up compreso ventilatore del mouse
2. Sistema di acquisizione dati e computer con programma LabView
3. Due trasduttori di pressione e misuratore di portata per il flusso perfusato
4. Trasduttore di pressione e flussometro (pnemotachometer) per il flusso delle vie aeree
5. Pompa ad alta frequenza oscillatoria e computer con programma di test Win
6. Boom / zoom microscopio, lampada
7. Bagno di riscaldamento con pompa ad alta velocità per IL-1 sistema

2. Preparazione del sistema di IL-1

1. Acqua distillata riscaldata a 37 ° C con il bagno di riscaldamento viene fatta circolare verso l'interno del sistema di IL-1.
2. Tutte le pompe, trasduttori e l'IL-1 cannula sono collegati mediante tubazioni pulite e tutti i tubi viene lavata con acqua distillata riscaldata a 37 ° C. Bolle d'aria, che poteva viaggiare nei polmoni e causare edema, deve essere rimossa. Tubazione dalla pompa di flusso oscillatorio al sensore di flusso e dal sensore di flusso alla cannula arteria polmonare sono lavata con PBS 1%.
3. Il P75 trasduttori di pressione sono azzerati chiudendo la valvola alla cannula, aprendo le valvole per l'atmosfera e poi premendo il pulsante automatico a zero sull'amplificatore PLUGSYS. Poi, la valvola per l'atmosfera è chiusa e la valvola per la cannula aperta.
4. Il pezzo di ceramica porosa nel percorso di ventilazione del sistema di IL-1 è bagnata per fornire umidità.

3. Soluzioni

1. Preparare il 3,5% in volume Ficoll-RPMI soluzione sterile e filtro dei media. Filtraggio dei media assicura l'assenza di particelle più grandi che potrebbero involontariamente embolizzare del polmone. L'utilizzo di supporti sterili riduce anche la probabilità di edema improvviso sviluppo nel polmone. Riempire una siringa da 10 ml con RPMI per la chirurgia e una siringa da 60 ml con RPMI per ogni prova sperimentale. Riscaldare il perfusato in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Preparare 1 ml di eparina peso corporeo 500IU/100g del mouse (approssimativa). Il sale è 158IU/mg eparina. Per un topo ~ 25 g, mix di 1,25 mg di sale eparina con la soluzione 1ml PBS in una provetta di piccole dimensioni.

4. Ventilazione di un mouse

1. Dopo un'iniezione intraperitoneale di 150 mg pentobarbital in soluzione per chilogrammo nel mouse, assicurarsi profonda anestesia eseguendo un pizzico duro con una zampa. Se non c'è reazione, preparare il mouse per un intervento chirurgico da appuntare le sue zampe anteriori di sughero per la stabilità. Nota: In tutta la profondità dell'anestesia esperimento è monitorato osservando attentamente l'animale. I perni in zampe e incisioni frequenti agiscono come stimoli nocivi, la mancanza di risposta a conferma che l'animale rimane in un piano chirurgico di anestesia.
2. Spray al petto con il 95% di alcool per bagnare la pelliccia e l'uso forcipe dritto per afferrare la pelle del collo. Taglio di 1 cm di apertura nella pelle usando le forbici diritte.
3. Una volta che l'interno del collo è esposta, rimuovere tutto il tessuto ghiandolare e bianco muscolare superficiale, cercando l'esofago e la trachea. Isolare l'esofago e trachea dal tessuto su entrambi i lati e posteriormente.
4. Inserire la pinza piegata piccolo sotto la trachea e afferrare un pezzo di sutura sul lato opposto. Tirare la sutura sotto la trachea e un nodo allentato chirurghi. Non stringere la sutura o legare il nodo.
5. Tagliare un piccolo angolo "v" nella trachea, con piccole forbici, non tagliare tutto il percorso attraverso la trachea. Spostare la bacheca di sughero e il mouse per il riscaldamento di IL-1 sistema. Usando i due pinze smussato, afferrare la cannula tracheale e la trachea sotto la "v". Quindi, far scorrere la cannula tracheale in tracheostomiaEA attraverso l'apertura "v". Stringere la sutura intorno trachea e cannula tracheale per fissare la cannula all'interno della trachea. Legare il nodo.
6. Iniziare la ventilazione (50% ispirazione, 90 atti / min, con inspirazione profonda) con aria ambiente.

5. Perfusione di un mouse ventilato

5.1. Accedi al ventricolo destro per iniettare eparina

1. Spray al petto del mouse con l'alcol nuovamente per bagnare la pelliccia. Togliere tutta la pelle sul petto sopra le costole con pinze e forbici dritto dritto. Taglio verso l'alto lungo lo sterno. Sollevare la pelle su ogni lato e poi tagliare la pelle seguendo la linea delle costole inferiori.
2. Afferrare il processo xifoideo alla base dello sterno con una pinzetta e un foro nella membrana usando le forbici diritte. Afferra il diaframma con le pinze e tagliare fuori le costole.
3. Afferrare il processo xifoideo di nuovo con le pinzette (mano sinistra) e utilizzare la palla-punta, forbici angolate per tagliare lo sterno e costole attraverso, facendo attenzione a non tagliare i polmoni, il cuore oi vasi sanguigni (utilizzare la palla punta su le forbici per guidare l'utente). Ci sarà del sangue, ma fintanto che la punta di diamante delle forbici è contro lo sterno, il cuore ei polmoni non saranno tagliati.
4. Afferrare le costole sul lato sinistro e tagliare via il più delle costole come necessario per esporre il cuore. Iniettare lentamente il ventricolo destro con 0,1 ml di soluzione di eparina. Questo passaggio è importante per prevenire coaguli di sangue nel polmone, che danneggiano le cellule endoteliali e potrebbe compromettere la perfusione. L'eparina deve essere iniettato, mentre il cuore batte ancora.

5.2. Cannulate la principale arteria polmonare

1. Tagliare via il resto delle costole (lato destro e sinistro) utilizzando la parte posteriore (arrotondati) fine del forcipe per spingere delicatamente i polmoni dalla parete toracica. Afferrando i polmoni stessi danneggiare il delicato tessuto. Contatto accidentale tra le punte a forbice e il tessuto polmonare anche causare danni.
2. Spostare il microscopio in posizione più polmonare. Tagliare il tessuto ghiandolare e adiposo nella parte superiore del cuore. Utilizzare le pinzette per tirare via dalle arterie e le vene e poi tagliare con le forbici a molla, mentre il tessuto è in tensione.
3. Utilizzando un altro insieme schietto di pinzette, scoop da destra a sinistra dalla parte superiore del cuore sotto atrio sinistro / ventricolo per ottenere la punta delle pinzette sotto l'aorta e l'arteria polmonare (PA). Procedere con cautela, non ci dovrebbe essere la resistenza alle pinzette. Utilizzando smussato pinzette riduce la probabilità di pungere accidentalmente l'arteria polmonare o dell'aorta.
4. Una volta che la punta pinzetta è sotto l'aorta e PA, afferrare un pezzo di sutura e tirare attraverso. Un nodo allentato chirurghi. Non stringere la sutura o legare il nodo.
5. Opzionale: utilizzare le forbici angolate per rimuovere la metà inferiore del corpo. Ridurre attraverso le costole e colonna vertebrale; taglio l'aorta e vena cava causerà una notevole quantità di sangue di fluire - utilizzare un Q-tip per arrestare il flusso. Mettere in un sacco per lo smaltimento.
6. Primo PA cannula con 4 ml di una siringa da 10 ml di RPMI. Doppia controllare che tutti i tubi è libero di bolle d'aria. Perfusione del polmone con acqua distillata o bolle si tradurrà in edema.
7. Tagliare una piccola tacca nella parete del ventricolo destro libero e inserire la cannula PA, puntando verso il basso e verso destra. La punta della cannula deve essere visibile attraverso la parete trasparente della PA. Infondere una piccola quantità di RPMI per confermare la posizione. Stringere la sutura intorno alla cannula aortica, e PA e legare il nodo. Si noti che a questo punto, l'aorta è anche legata off in modo perfusione reale non dovrebbe iniziare fino a quando l'atrio sinistro è cannulata.

5.3. Cannulate l'atrio sinistro

1. Tagliare una tacca nella parte inferiore del ventricolo sinistro e la sinistra inerte atriale (LA) cannula, puntando verso l'alto. Leggera pressione può essere necessaria per aprire la valvola mitrale in questa direzione. Nella posizione corretta, la punta della cannula scivolerà attraverso ed essere sicura senza sutura.

5.4. Iniziare la perfusione

1. Manualmente infondere RPMI dalla siringa da 10 ml a 0,3 ml al minuto fino a quando RMPI è evidente nel tubo deflusso (rosa-ish colore in contrasto con la chiara PBS). Se non c'è flusso nel tubo di deflusso, riposizionare la cannula Los Angeles. Se non efflusso possono essere ottenuti con ri-posizionamento, verificare la presenza di una perdita in arteria polmonare. Una perdita di strappo o in arteria polmonare non possono essere riparati, questo è il motivo per interrompere l'esperimento.
2. Collegare una siringa da 60 ml per la cannula PA attraverso il sistema di IL-1 e iniziare l'infusione 1ml/min di perfusato, controlli per individuare perdite e assicurandosi che i polmoni diventano bianchi, che dimostra che RPMI sta sostituendo il sangue nei polmoni. Profumato con flusso lento per due minuti.

6. Misura pulsatile e costante pressione polmonare-Flow Relazioni

1. Per gli studi di flusso pulsatile, in primo luogo gli oscillatori spostamenti del pistone della pompa ai livelli desiderati per ogni frequenza nel WinTest programma basato su esperimenti precedenti. Variabilità a causa della struttura del polmone e della meccanica, gli spostamenti devono essere adattati per ogni mouse. Impostare flusso costante al livello desiderato. Aprire la valvola alla pompa oscillatorio e iniziare la registrazione dei dati a destra prima di eseguire il profilo oscillatorio flusso (programma Wintest). Aprire il file di dati e tracciare il flusso sperimentale (Q) in Excel. Regolare il oscillatorio spostamenti del pistone della pompa ad ogni frequenza (programma Wintest) in modo che Q max e Q min sono come desiderato.
2. Per gli studi flusso costante, chiudere la valvola alla pompa oscillatorio. Se questa valvola viene lasciata aperta, la pompa oscillatorio si comporta come un condensatore, attenuare i cambiamenti da una portata all'altra. Raccogliere dati per almeno 10 secondi ad ogni portata o fino a quando la pressione PA non varia di oltre il 5%.
3. Per misure di portata sia pulsatile o continuo, ventilazione vecchio ad una pressione costante prima raccolta dei dati. Riprendere la ventilazione immediatamente dopo la raccolta dei dati.
4. Guarda per RPMI nel tubo delle vie aeree, questa è la prova di edema ed è motivo di interrompere l'esperimento. Inoltre, non lasciare che RPMI raggiungere la pressione delle vie aeree o sensori di flusso, perché danneggia i trasduttori.

7. Rappresentante dei risultati:

Rappresentante Risultati costante:

Nel polmone isolato set-up lo sperimentatore ha la capacità di controllare indipendentemente non solo la portata Q polmonare ma anche LAP pressione delle vie aeree pressione P _dell'aria e dell'atrio sinistro. Questo è vantaggioso perché Q, P _aria e LAP influenzare il sistema vascolare polmonare e la conseguente pressione arteriosa polmonare PAP. Un altro vantaggio è che i risultati ottenuti sono indipendenti dal sistema nervoso simpatico tono ^1, stato del volume, e l'anestesia ^2.

Cambiamenti indotti dal PAP gradini cambiamenti in Q fissa per P _aria e fisso o variabile LAP sono mostrati in Figura 1. Si noti che nella preparazione del polmone isolato, la cannula LAP è tipicamente collegato a tubi che dirige il perfusato in un contenitore dei rifiuti. Con questo tubo in posizione, LAP è linearmente dipendente da causa di flusso di Poiseuille Q. Tuttavia, l'altezza della presa e il contenitore dei rifiuti può essere regolata manualmente per fornire una costante, diverso da zero LAP o il tubo può essere rimossa per consentire a zero LAP che è indipendente da Q.

Rappresentante Risultati pulsatile:

Mentre il flusso pulsatile forme d'onda arbitrarie possono essere generati con questo sistema, che tipicamente generano il flusso della forma Q = 3 + 2 peccato (2 f πt) ml / min a frequenze di f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz per valutare l'impedenza linearizzata del sistema vascolare polmonare (Figura 2: pannello superiore). Dalle misure conseguenti PAP, LAP e Q, grandezza impedenza vascolare polmonare (Z) e di fase (θ) sono calcolati in primo luogo un ciclo completo di decomposizione sinusoidale di AP = PAP-LAP e Q ad ogni frequenza imposto sinusoidale portata in una serie di armoniche sinusoidali usando una trasformata di Fourier. Il rapporto tra la pressione di trasformare il flusso dei rendimenti trasformare l'impedenza polmonare vascualar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), che ha ampiezza e la fase Z θ. Impedenza di ingresso Z _0, impedenza caratteristica Z _C e indice di riflessione delle onde R _W, sono calcolati dalla magnitudine impedenza. In particolare, Z ₀ è calcolata da Z a 0 armonica (f = 0 Hz) media su tutte le frequenze, Z _C viene calcolato come la media di Z tra il primo minimo (5 Hz) e 20 Hz, _W e R si calcola come (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Figura 1 costante flusso di forme d'onda (riga superiore) e pressioni che ne derivano. (Seconda fila: PAP, P _aria, LAP) in funzione del tempo con diverse combinazioni di LAP e _aria P. La riga in basso mostra PAP vs D. (A) e (B), LAP aumenta e diminuisce con Q perché il tubo di deflusso è stato al suo posto. Questo tubo è stato rimosso per (C) in modo che LAP è costante e indipendente da Q. In (D) e (E) l'altezza del tubo di uscita è stata regolata manualmente in modo che LAP è superiore, ma indipendente da D. P _aria sia a end-inspiratoria (A, C, D) o di fine espirazione (B, E) la pressione.

Figura 2 pulsatile del flusso d'onda Q (pannello superiore) e la pressione risultante (pannello inferiore: PAP, LAP e P _aria). In funzione del tempo. Da queste pulsatile pressione polmonare flusso delle relazioni, PVZ può essere calcolato, che riflette il totale post-carico del ventricolo destro.

Discussione

Passaggi critici della chirurgia

E 'fondamentale che si fa attenzione quando si taglia la gabbia toracica lontano dai polmoni. I polmoni devono essere completamente esposti e disinibito da parte dei tessuti circostanti durante l'inflazione, ma non danneggiate durante il processo di isolamento. L'uso di un oggetto piatto come il back-end della pinza può essere utilizzata per tenere il polmone dalla parete toracica modo che ci sia un percorso chiaro per le forbici per tagliare. Un alt...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 ml	Fisher Scientific	14-829-10F
Siringa da 10 ml	Fisher Scientific	14-823-2A
Siringa da 60 ml	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI con GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Filtri per Flacone Fisher	Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100G
Eparina	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Forbici a iride a sfera angolate	Strumenti per la scienza fine	14109-09
Forbici a molla Vannas - Lame da 4 mm	Strumenti per la scienza	15018-10
Forbici per l'iride fine - Strumenti per	la scienza	fine dritti14106-09
Dumont #5/45 Forcipe	Strumenti per le scienze	11251-35
Dumont Forcipe per biologia medica	Strumenti per le scienze	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Paragonabile a Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Sistema polmonare di topo perfuso isolato	Harvard Apparatus	739904
Trasduttore di pressione sanguigna P75 per modulo PLUGSYS	Harvard Apparatus	730020
TS410 Moduli di flusso	Transonic	TS410
ME 4 PXN Sensori di flusso in linea PXN di precisione	Transonic	ME 4 PXN
Pompe multisiringa Cole-Parmer	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Fiala	Amatheon