Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.
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Articolo metodologico
Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine della cromatina in Living cellule staminali embrionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) consentono lo studio della dinamica delle proteine nelle cellule viventi con una buona risoluzione spaziale e temporale. Qui si descrivono come eseguire FRAP e FLIP analisi delle proteine della cromatina, tra H1 e HP1, nel topo staminali embrionali (ES) cellule. In un esperimento FRAP, le cellule sono transfettate, o transitoriamente o stabilmente, con una proteina di interesse fusa con la proteina fluorescente verde (GFP) o loro derivati (YFP, CFP, Ciliegio, ecc.) Nel transfettate, cellule fluorescenti, un intenso fascio laser focalizzato candeggine una regione relativamente piccola di interesse (ROI). La lunghezza d'onda laser è selezionato in funzione della proteina fluorescente utilizzato per la fusione. La luce laser sbiancanti irreversibilmente il segnale di fluorescenza delle molecole nella ROI e, subito dopo lo sbiancamento, la ripresa del segnale di fluorescenza nell'area sbiancato - mediata dalla sostituzione delle molecole sbiancato con le molecole di greggio - è controllata mediante l'imaging lasso di tempo. Le curve generate recupero fluorescenza fornire informazioni sulla mobilità della proteina. Se le molecole fluorescenti sono immobile, non il recupero fluorescenza sarà osservato. In un approccio complementare, perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), il raggio laser decoloranti stesso punto ripetutamente e l'intensità del segnale è misurata in altre parti della cellula fluorescenti. Esperimenti FLIP quindi misurare il decadimento del segnale, piuttosto che di recupero fluorescenza e sono utili per determinare la mobilità delle proteine e proteine la spola tra compartimenti cellulari. Legame transitorio è una proprietà comune della cromatina proteine associate. Pur essendo la frazione principale di ogni proteina cromatina è legato alla cromatina in ogni momento allo stato stazionario, il legame è transitoria e maggior parte delle proteine della cromatina hanno un elevato turnover di cromatina, con un tempo di permanenza nell'ordine dei secondi. Queste proprietà sono cruciali per la generazione di elevata plasticità di espressione del genoma 1. Fotodecolorazione esperimenti sono quindi particolarmente utili per determinare la plasticità cromatina con GFP-fusione versioni della cromatina proteine strutturali, specialmente nelle cellule ES, dove lo scambio dinamico delle proteine della cromatina (tra cui le proteine eterocromatina 1 (HP1), un linker H1 e istoni core) è più alto che in cellule differenziate 2,3.
Protocollo
1. Placcatura le cellule ES
T = 0 ore
MEF placcatura
- Cappotto di imaging dal vivo ben 8-μ-Slides (ibidi, Monaco, Germania), con gelatina o in vetri a camera di copertura (Lab-Tek, Rochester, NY) o in fondo di vetro piatti cultura (MatTek, Ashland, MA). Lasciare agire per 5-30 minuti e aspirare via libera gelatina.
- Seed 22.000 MEF / pozzetto in 250 microlitri di volume totale di DMEM [supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS)]. Consentono alle cellule di crescere in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO2).
T = 6 ore
ES cellula placcatura
- Aspir....
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Discussione
A differenza delle tecniche più disponibile, che coinvolgono cromatina purificato da popolazioni di cellule o cellule fisse, gli esperimenti FRAP seguire i cambiamenti nelle dinamiche delle proteine della cromatina in cellule viventi. Abbiamo trovato la dinamica delle proteine della cromatina per essere un buon indicatore per la plasticità cromatina. Tuttavia, perché richiede di fusione del gene di interesse con GFP, l'aggiunta del tag fluorescenti possono interferire con la funzione della proteina. Così, prima .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Meshorer, specialmente Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout e Alva Biran, per commenti critici e per la risoluzione dei problemi photobleaching esperimenti su base giornaliera. EM è un Joseph H. e R. Braun Belle Senior Lecturer in Life Sciences ed è sostenuta dalla Israel Science Foundation (ISF 943/09), il ministero israeliano della Sanità (6007) l'Unione europea (IRG-206872 e 238176), Israele Cancer Research Foundation, l'interno Grants applicativi Medica della Hebrew University e la Psicobiologia Israel Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Gelatina | Merck | 1,04078 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 | |
| Transit-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| 8-ben μ-Slides | ibidi | 80826 |
Riferimenti
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
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Ristampe e permessi
