Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Sommario

Microscopia ottica con risoluzione fotoacustico (OR-PAM) è una tecnologia emergente in grado di assorbimento di imaging ottico contrasti In vivo Cellulari con risoluzione e sensibilità. Ecco, mettiamo a disposizione una istruzione visualizzate sui protocolli sperimentali di O-PAM, inclusa la configurazione del sistema di allineamento del sistema, tipico In vivo Procedure sperimentali, e sistemi di imaging funzionale.

Abstract

Microscopia ottica, fornendo preziose informazioni a livello cellulare e degli organelli, è stata ampiamente riconosciuta come una tecnologia abilitante biomedica. Come i pilastri in vivo tridimensionale (3-D) microscopia ottica, single-/multi-photon microscopia a fluorescenza e la tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno dimostrato la loro sensibilità straordinaria per i contrasti di scattering e fluorescenza ottica, rispettivamente. Tuttavia, il contrasto di assorbimento ottico di tessuti biologici, che codifica le informazioni essenziali fisiologico / patologico, non è stato ancora valutabili.

L'emergere di photoacoustics biomediche ha portato ad una nuova branca della microscopia ottica ottici risoluzione microscopia fotoacustico (OR-PAM) ^1, dove si concentra la radiazione ottica al limite di diffrazione di raggiungere cellulare ¹ o addirittura subcellulare risoluzione di ² livello laterale. Come un prezioso complemento agli attuali tecnologie di microscopia ottica, O-PAM porta in almeno due novità. Il primo e più importante, O-PAM rileva contrasti l'assorbimento ottico con una sensibilità straordinaria (cioè 100%). La combinazione di O-PAM con microscopia a fluorescenza ³ o con ottiche di diffusione basati su ^{4 Ottobre} (o con entrambi) offre una completa proprietà ottiche dei tessuti biologici. In secondo luogo, O-PAM codifica assorbimento ottico in onde acustiche, in contrasto con i processi di pura ottica in microscopia a fluorescenza e ottobre, e fornisce sfondo senza rilevamento. La rilevazione acustica in O-PAM mitiga gli effetti della dispersione ottica degradazione del segnale ed elimina naturalmente possibili interferenze (cioè crosstalks) tra eccitazione e di rilevamento, che è un problema comune in microscopia a fluorescenza a causa della sovrapposizione tra l'eccitazione e spettri di fluorescenza.

Unico per l'imaging assorbimento ottico, O-PAM ha dimostrato ampia applicazioni biomediche dalla sua invenzione, tra cui, ma non limitati a, neurologia ^{5, 6,} oftalmologia ^{7, 8, 9} biologia vascolare, dermatologia e ^10. In questo video, ci insegnano la configurazione del sistema e l'allineamento di O-PAM e le procedure sperimentali per l'imaging in vivo microvascolari funzionale.

Protocollo

1. Configurazione del sistema

1. Radiazione ottica
   1. Sorgente di radiazione ottica: un diodo-pompato a stato solido laser pulsato (INNOSLAB, Edgewave) e un laser a colorante (CBR-D, Sirah).
   2. Il raggio laser di uscita (ampiezza di impulso: 7 ns) è focalizzata da una lente condensatore (LA1131, Thorlabs) per passare attraverso un foro stenopeico di 50 micron (P50C, Thorlabs).
   3. Il foro stenopeico è posizionato un po 'lontano dal fuoco della lente condensatore che corrisponda al diametro del foro stenopeico con la fondamentale modalità diametro del raggio per un efficace filtraggio spaziale.
   4. Il raggio filtrato è attenuato da un filtro a densità neutra (NDC-50C-2M, Thorlabs) e poi accoppiati in una modalità singola fibra ottica (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. L'uscita in fibra riempie l'apertura posteriore di un obiettivo microscopio (RMS4X, Thorlabs) per ottenere una diffrazione limitata nel centro ottico di circa 2,6 micron alla lunghezza d'onda di 570 nm.
2. Rilevamento ultrasonico
   1. Trasduttore ad ultrasuoni: 50-MHz di frequenza centrale (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. Il trasduttore ad ultrasuoni è collegato ad un fatto in casa acustico-ottico a fascio combinatore ¹¹ per il rilevamento ultrasonico, che è allineato coassialmente con la diffrazione limitata radiazione ottica.
   3. Una cavità sferica è terra dal fondo del combinatore per la produzione di una lente acustica. Questa lente acustica ha una apertura numerica di 0,5 in acqua e dà un diametro acustico focale di 43 micron a 50-MHz di frequenza centrale.
   4. I fuochi ottici e acustici sono allineati confocally per massimizzare la sensibilità di rilevazione.
3. Accoppiamento acustico
   1. Secco accoppiamento ad ultrasuoni è impiegato per evitare sommergendo animali da esperimento in acqua, che è stato utilizzato nei primi mesi del sistemi di imaging fotoacustico ^12.
   2. Una finestra di imaging si apre sul fondo di una piastra di Petri (9 cm di diametro) ed è sigillato con una membrana ad ultrasuoni e otticamente polietilene trasparente.
   3. Gel ultrasuoni (Clear Image, SonoTech) tra la membrana in polietilene e l'oggetto da coppie ripreso l'onda generata fotoacustico dall'oggetto alla piastra di Petri, e l'acqua deionizzata nella scatola di Petri coppie ulteriormente l'onda al sommerso OR-PAM testa di imaging .
4. Elettronica
   1. Il segnale fotoacustico rilevato dal trasduttore ad ultrasuoni è amplificata da due amplificatori in cascata (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. Il segnale amplificato viene digitalizzato da un 14-bit di acquisizione dati (DAQ) (CompuScope 14200, Gage Scienze Applicate) ad una frequenza di campionamento di 200 MS / s.
5. Scansione schema
   1. Bidimensionale (2-D) raster di scansione del OR-PAM testa di immagini lungo l'orizzontale (xy) piano è controllato da un personal computer, che attiva sia la scheda DAQ e il laser pompa. Il segnale di trigger è sincronizzato con l'orologio-out del segnale dalla scheda DAQ.
   2. L'asse veloce della 2-D scanner è definita come la direzione della sezione di scansione (B-scan).
   3. Una sequenza di B-scan le immagini possono essere acquisite traducendo la testa di immagini lungo l'asse lento per formare una immagine volumetrica, che possono essere visualizzati sia in diretta 3-D di rendering o in un 2-D sporgenza massima ampiezza (MAP) immagine .

2. Sistema di allineamento

1. Usare il pulse-echo ultrasuoni e un riflettore ad ultrasuoni per determinare la posizione del piano acustico focale (ovvero, il tempo di ritardo dal segnale di trigger al massimo impulso-eco segnale ultrasonico). Questo passaggio è necessario per essere eseguita una sola volta durante la costruzione del sistema O-PAM.
2. Massimizzare l'efficienza di accoppiamento della fibra monomodale.
3. Applicare il gel ultrasuoni sulla parte superiore di un oggetto otticamente assorbente (ad esempio, un pezzo di nastro adesivo nero) e delicatamente allegare sotto la finestra di imaging nella scatola di Petri riempite con acqua deionizzata.
4. Abbassare la testa di esposizione in acqua, ed eliminare le bolle d'aria intrappolate sotto la lente acustica.
5. Regolare la testa di esposizione fino a quando il segnale fotoacustico dell'oggetto assorbente acustico dal piano focale, che può essere giudicata dal ritardo acustico.
6. Regolare la posizione verticale (cioè, la posizione z) del microscopio obiettivo di massimizzare l'ampiezza del segnale generato dal fotoacustico oggetto piatto. L'ampiezza del segnale massimizzato suggerisce che il focus ottico sia allineato con il centro acustico in direzione verticale.
7. Regolare la posizione orizzontale (cioè posizioni, x e y) l'obiettivo microscopio fotoacustico finché il segnale generato dal bersaglio mostra uno schema simmetrico. La simmetria suggerisce che il focus ottico sia allineato con il centro acustico in direzione orizzontale.
8. Ripetere i passi 2.6 e 2.7 fino a quando il segnale fotoacustico è ottimizzato sia in simmetria e ampiezza.

3. A sa mple procedura sperimentale in vivo OR-PAM del mouse orecchio vascolarizzazione

1. Questo passaggio non è richiesto per topi nudi. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail [ricetta: 1 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,1 ml xylazina (100 mg / ml) e 8,9 ml di soluzione salina; dosaggio: 0,1 ml/10 g]. Radersi i capelli nell'orecchio, e ulteriormente depilare i capelli residua con Crema personalizzate e sicure (Categoria #: 82565, American International Industries) prima di pulirlo con acqua deionizzata. Si noti che tale depilazione potrebbe leggermente irritare la vascolarizzazione della pelle e quindi è meglio effettuata 24 ore prima l'esperimento previsto.
2. Accendere il sistema laser fotoacustica, e controllare l'allineamento del sistema.
3. Anestetizzare il mouse con il 3% isoflurano vaporizzato dal gas inalazione (la portata tipica è 1,0-1,5 l / min, a seconda del peso del corpo dell'animale), e mantenere l'anestesia con l'1% isoflurano tutto l'esperimento. Uso medico aria è raccomandata come l'inalazione di gas per mantenere il mouse in normale stato fisiologico.
4. Trasferire il mouse su un palco stereotassica e controllare la sua temperatura corporea a 37 ° C con una piastra elettrica.
5. Appiattire l'orecchio del mouse su un piatto di plastica e applicare uno strato di gel per ultrasuoni sulla parte superiore dell'orecchio. Evitare di inglobare bolle d'aria all'interno del gel. Poi, posto l'orecchio sotto la finestra di imaging e sollevare lentamente la fase animale fino contatti gel l'ecografia il fondo della membrana in polietilene. A contatto morbide è necessario perché premendo l'orecchio contro la membrana può influenzare il flusso di sangue nelle orecchie.
6. Morsetto un pulsossimetro alla gamba del mouse o la coda di monitorare il suo stato fisiologico, e applicare una pomata per gli occhi per prevenire la secchezza e danni accidentali laser agli occhi del mouse.
7. Abbassare la testa di esposizione fino a quando la lente acustica è immerso in acqua deionizzata e rimuovere le bolle d'aria intrappolate sotto la lente acustica.
8. Controllare la fluenza laser per assicurarsi che sia nel rispetto degli standard di sicurezza del laser della American National Standards Institute ^13. La fluenza laser non deve superare 20 mJ / cm ^2, che si traduce in 80 nj di energia laser a impulsi quando il raggio laser viene focalizzato a 150 micron sotto la superficie della pelle.
9. Impostare il laser per l'esterno-trigger mode e avviare la scansione di prova. Regolare la posizione z del capo di imaging fino a quando il segnale più forte è fotoacustico dal piano acustico focale.
10. Impostare correttamente i parametri di scansione e avviare l'acquisizione formale delle immagini.
11. Dopo l'esperimento, spegnere il laser, sollevare la testa immagini fuori dall'acqua deionizzata, abbassare la fase animale a rilasciare il mouse, pulire l'orecchio del mouse con acqua deionizzata, spegnere il sistema di anestesia e il regolatore di temperatura, e scaricare il mouse dal palco stereotassica.
12. Se l'imaging ripetitivi è necessario, mettere il mouse in una incubatrice con la temperatura ambiente a 37 ° C. Ritorna il mouse per l'impianto animale dopo che si sveglia in modo naturale. Altrimenti, seguire i protocolli animale eutanasizzare e smaltirlo.

4. Funzionale OR-PAM di concentrazione totale e la saturazione di ossigeno dell'emoglobina

1. Ossiemoglobina (HBO ₂₎ e deossiemoglobina (HBR) sono le due principali forme di emoglobina, la prevalente fonte endogena fotoacustico nel campo del visibile dello spettro. HbO ₂ e HBR sono distinti spettri ottici di assorbimento e quindi può essere spettralmente differenziati per quantificare sia la concentrazione totale (HBT) e la saturazione di ossigeno (SO ₂₎ di emoglobina ^5. Qui ci sono due linee guida per aiutare a selezionare corretta lunghezze d'onda ottiche per SO ₂ misure:
2. Lunghezze d'onda dovrebbe essere selezionata all'interno del Q-banda dello spettro di assorbimento dell'emoglobina (ad esempio, 550-600 nm) per garantire un sufficiente rapporto segnale-rumore e la penetrazione adeguata.
3. Lunghezze d'onda in cui i coefficienti di assorbimento di HBO ₂ e HBR ha una pronunciata differenza (ad esempio, HBR dominante 561 nm e HBO _2-dominante 578 nm) sono raccomandati.

Oltre SO _2, HBT può essere calcolato sommando [HBR] e [HbO _2] insieme, o può essere misurata direttamente a lunghezze d'onda dello spettro isosbestic coefficiente di estinzione molare di emoglobina (ad esempio, 530 nm, 545 nm, 570 nm, e 584 nm) ^14, dove HBR e HBO ₂ hanno uguali coefficienti di estinzione molare.

5. Rappresentante dei risultati:

Mostrato nella Figura 1 è l'anatomia vascolare e SO ₂ in un orecchio vivente topo nudo ripreso da doppia lunghezza d'onda (561 e 570 nm) O-PAM. Il tipico tempo di acquisizione immagini per doppia lunghezza d'onda sO ₂ misurazioni di tale regione di interesse (dimensione immagine: 10 mm x 10 mm, passo: 2,5 micron x 5 micron) è ~ 80 min.

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Figura 1. Ottico in vivo risoluzione microscopia fotoacustico. MAP di (A) la concentrazione totale di emoglobina che mostra l'anatomia vascolare (acquisita a 570 nm) e (B), la saturazione di ossigeno dell'emoglobina (acquisita a 561 nm e 570 nm) in un orecchio topo nudo. (C) primo piano della regione in scatola a pannello (A). La barra di scala nel pannello (A) vale sia per (A) e (B).

Discussione

In questo video, forniamo istruzioni dettagliate sui protocolli sperimentali di O-PAM, tra cui la configurazione del sistema, l'allineamento del sistema, e la tipica procedure sperimentali. Senza etichetta, non invasivo O-PAM ha permesso studi di funzionamento microvascolare e il metabolismo su una sola base capillare e possiede quindi la possibilità di espandere la nostra comprensione del microcircolo legati fisiologia e patologia. Microphotoacoustics è attualmente in produzione questo O-PAM sistema.

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