Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell'organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.
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Articolo metodologico
Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'organo di Corti dei mammiferi è un mosaico altamente ordinato cellulari di capelli mechanosensory e nonsensory cellule di supporto
(Recensione a 1,2). Visualizzazione di questo mosaico cellulare spesso richiede che l'organo del Corti è sezionato. In particolare, il pilastro nonsensory e le cellule Deiters ', i cui nuclei si trovano basale rispetto alle cellule dei capelli, non possono essere visualizzati senza cross-sezionare l'organo del Corti. Tuttavia, il delicato citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, inclusi i processi multa citoplasmatica del pilastro e cellule Deiters ', è difficile da conservare per procedure istologiche di routine come la paraffina e crio-sezionamento, che sono compatibili con le tecniche standard di colorazione immunoistochimica.
Qui descrivere una procedura semplice e robusta costituita da vibratome sezionamento della coclea, la colorazione immunoistochimica di queste sezioni vibratome a monte tutto, seguita da microscopia confocale. Questa procedura è stata utilizzata ampiamente per l'analisi immunhistochemical di molti organi, tra cui la gemma dell'arto topo, pesce zebra intestino, fegato, pancreas e cuore (vedi 3-6 per esempi selezionati). Inoltre, questa procedura è stata sucessful sia per l'imaging e quantitificaton del numero di cellule mutanti pilastro di organi e il controllo delle Corti sia in embrioni di topi adulti e 7. Questo metodo, tuttavia, non è attualmente molto utilizzato per esaminare l'organo di Corti dei mammiferi. Il potenziale di questa procedura per garantire sia la conservazione potenziata del citoarchitettura multa dell'organo del Corti adulti e consentire la quantificazione dei vari tipi di cellule è descritto.
Protocollo
1. Isolamento e fissazione interna delle orecchie
- Per l'analisi di patterning cellulare in dell'organo del Corti, eutanasia opportunamente allestita embrioni o gli adulti.
- Sezionare la capsula otica, che contiene l'orecchio interno membranoso. Nel topo, questo può essere fatto facilmente su embrioni a embrionale (E) giorno 14.5 e anziani, in cui E0.5 è il giorno in cui è stata rilevata una spina vaginale. Dissezione della capsula otica avviene prima per decapitazione e l'apertura del cranio sulla linea mediana. Rimuovere cervello per esporre ciascun orecchio (Fig. 1A). Orecchio interno può essere sborsato intatto pinze utilizzando (come Dumont # ....
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Discussione
La procedura di sezionamento vibratome, seguita da immagini immunoistochimica e confocale permette la visualizzazione delle dell'organo del Corti, con minimo danno tissutale. Chiaramente, le immagini confocale preso dalle regioni interne della sezione vibratome spettacolo eccellente conservazione della morfologia cellulare che è limitata solo dalla fissazione artefatti. Immagini confocale preso vicino alle due superfici di taglio di una sezione vibratome sono spesso indistinguibili dalle immagini provenienti dalle r.......
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Dichiarazioni
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Medical College of Wisconsin IACUC.
Ringraziamenti
L'autore ringrazia vivamente l'uso di Ricerca dei Bambini Nucleo Istituto Imaging per la microscopia confocale e il dottor Zhang Jian per il suggerimento di montare sezioni utilizzando perline agarosio. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere DC010387.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Leica VT1000S vibrante lama microtomo | Leica | ||
| Zeiss LSM510 microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | ||
| Studente Dumont # 5 Pinze | Strumenti Scienza multa | 91150-20 | |
| Ultrapura Bassa Punto di fusione Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding stampo | Polysciences | 18986 o 18646A | |
| albumina di siero bovino | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Siero di capra | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 di capra anti-IgG di coniglio | Invitrogen | A-11036 | Diluizione 1:1000 |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vuoto grasso | Pescatore | S41718 | |
| Affi-Gel Gel Blu | Bio-Rad | 153-7301 |
Riferimenti
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
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Ristampe e permessi
