Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Sommario

Questo monte tutto In situ protocollo discute passaggi critici che assicurano riproducibile risultati di alta qualità per gli studi di espressione genica in E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita.

Abstract

Montare tutto ibridazione in situ è un approccio molto informativo per la definizione di schemi di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ sono lunghi e tecnicamente impegnativo, con passi più importanti che insieme contribuiscono alla qualità del risultato finale. Questo protocollo descrive in dettaglio alcuni punti chiave del controllo della qualità per l'etichettatura sonda l'ottimizzazione e le prestazioni. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei passi fondamentali necessari per ottenere risultati di alta qualità riproducibile. In primo luogo, si descrive la generazione di digossigenina (DIG) sonde marcate nella trascrizione dell'RNA tramite modelli in vitro di DNA generati mediante PCR. Ci descrivono tre saggi critici di controllo di qualità per determinare la quantità, l'integrità e l'attività specifica del DIG-sonde marcate. Questi passaggi sono importanti per la generazione di una sonda di sensibilità sufficiente per rilevare mRNA endogeni in un embrione di topo intero. Inoltre, si descrivono i metodi per la fissazione e lo stoccaggio di E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita per l'ibridazione in situ. Poi, si descrive metodi dettagliati di limitata digestione proteinasi K degli embrioni reidratati seguita da i dettagli delle condizioni di ibridazione, di post-ibridazione lavaggi e trattamenti per eliminare RNAsi non specifici ibridazione sonda. AP-coniugato anticorpale è utilizzato per visualizzare le sonda marcata e rivelare il pattern di espressione del trascritto endogena. Risultati rappresentativi sono riportati da esperimenti di successo e tipici esperimenti non ottimale.

Protocollo

1. Generazione Riboprobe via di trascrizione in vitro

1. Della preparazione dei prodotti PCR per la trascrizione nei modelli in vitro.
   1. Progettare primer PCR con sequenze di trascrizione promotore dei fagi nelle loro estremità 5 '.
      Nota: La sequenza promotore aggiunto 5'end del senso filamento di PCR saranno utilizzati per la trascrizione della sonda senso, e la sequenza promotore aggiunto 5'end del primer antisenso PCR sarà utilizzata per sintetizzare il senso anti-sonda ^1-3. Non abbiamo rilevato alcuna differenza in termini di efficienza di trascrizione tra i modelli che contengono....

Discussione

I metodi descritti in questo protocollo sono stati adattati da un certo numero di fonti diverse e ottimizzato per montare tutto E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita. Metodi per montare tutto ibridazione in situ degli embrioni dei vertebrati prima apparizione nei primi anni 1990 ^2,5-12. Questo protocollo è stato adattato principalmente dai metodi sviluppati per gli embrioni di Xenopus ^7,8 e ^2,11 del mouse. Nel nostro protocollo una grande enfasi è posta sulla valutazione de.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome	Tipo	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Digossigenina-11-uridina-5'-trifosfato	Reagente	Roche	11209256910
Ribonucleosidi trifosfato Set	Reagente	Roche	11277057001
Colonne Spin rapido per radiomarcato purificazione dell'RNA	Fornitura	Roche	11274015001
T7 RNA polimerasi	Reagente	Roche	10881767001
SP6 RNA polimerasi	Reagente	Roche	10810274001
T3 RNA polimerasi	Reagente	Roche	11031163001
CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi	Reagente	Perkin Elmer	BLU008X250UC
DNasi I ricombinante, RNasi-free	Reagente	Roche	4716728001
Urea, incolore a bianco cristalli o polvere cristallina	Reagente	Pescatore	BP169-500
Gel di caricamento del buffer	Reagente	Ambion	AM8547
Hybond-N +, Amersham	Fornitura	GE Healthcare	RPN82B
UV Stratalinker 2400	Attrezzatura	Stratagene
Dietil pirocarbonato	Reagente	Sigma	D5758-100ML
Eparina sodica	Reagente	Acros	41121-0010
30% di perossido di idrogeno in acqua	Reagente	Fisher Scientific	BP2633-500
Gluteraldehyde, 8% EM di grado	Reagente	Polysciences	0 / 710	Usare con cautela secondo le istruzioni del produttore
Blocco reagente	Reagente	Roche	11096176001	Fare in 5% fotografici e conservare a -20 ° C
Proteinasi K	Reagente	Roche	3115852001
RNase A	Reagente	Roche	10109142001	Fai come 10 mg / ml di brodo e conservare a -20 ° C.
RNasi T1	Reagente	Roche	10109193001
Ultrapura Formammide	Reagente	Invitrogen	15515-026
Levamisolo cloridrato	Reagente	ICN Biomedicals. Inc	155228
Acido ribonucleico dal lievito torula, tipo VI	Reagente	Sigma	R6625	fenolo / cloroformio estratto più volte e precipitato, risospesi in DEPC-dH2O e conservati a -20 ° C
Anti-digossigenina-AP frammenti Fab	Reagente	Roche	11093274910
BM Viola AP substrato, precipitando. Pronto da usare soluzione.	Reagente	Roche	11 442 074 001
4 ml, trasparente, chiuso Top, Deposito Vial Kit Convenienza	Fornitura	Scientifico nazionale	B7800-2
Agitare N Bake ibridazione forno	Attrezzatura	Boekel scientifico	136400
Biopsia Sure-Tek	Fornitura	Fisherbrand	15-200-402C
Paraplast Inoltre tessuto mezzo di inclusione	Reagente	Fisherbrand	23-021-400
Peel-A-Way e getta di plastica tessuto embedding stampi	Fornitura	Polysciences	18646A
Colorfrost Inoltre Microscopio diapositive	Fornitura	Fisherbrand	12-550-17
Nuclear Fast Red	Reagente	Sigma	N8002
Cytoseal 60	Reagente	Richard-Allan scientifico	8310-16