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1. Inoculazione di tumore in CAM embrione aviaria
- Preparare conchiglia meno embrioni di pollo fecondate, come descritto 8.
- Il 9 ° giorno di sviluppo embrionale, assemblare un micro-iniettore con un 18-gauge collegato su siringa da 1 ml. Tagliare un pezzo di 5-6 centimetri di tubo Tygon (1 / 32 "di diametro interno, 3 / 32" di diametro esterno, 1 / 32 "spessore della parete) e inserire con cautela bisello dell'ago nel tubo. Circa 4-5 cm di tubo dovrebbe si estendono dalla punta dell'ago (figura 1a).
- Riempire la siringa e il tubo con la sospensione cellulare. Quindi, inserire un ago di vetro microiniezione alla fine del tubo e con attenzione rimuovere eventuali bolle d'aria.
- Iniettare Giorno 9 embrioni (figura 1b) in un ambito di dissezione con un illuminatore con 10,000-100,000 cellule del cancro come un bolo all'interno del CAM (Figura 1c). Iniettare lentamente e con attenzione le cellule in modo che l'ago è nel posto giusto per le cellule di formare un bolo visibile all'interno della CAM. Le cellule che a goccia sulla superficie CAM può essere pulito con applicatore Kimwipe o altro.
- Ritorna embrioni incubatore umidificato a 38 ° C al 60% di umidità e permettere tumore di crescere e vascolarizzano (fino a 7 giorni).
2. Preparazione di nanoparticelle
- Per preparare fluorescente nanoparticelle CPMV per l'iniezione in embrione di pollo; diluire le nanoparticelle virale (come sintetizzato in 8 in PBS, pH 7,4, ad una concentrazione di 100 mg / ml miscela Vortex bene prima dell'uso e centrifugare per un minuto di togliere qualunque. aggregati. sonicazione può essere utile anche a seconda coniugati e il grado di aggregazione. Stock di CPMVs fluorescente sono stabili per almeno 1 anno se conservato a 4 ° C al buio. Controllare periodicamente le scorte da mettere un paio di gocce su un vetrino e controllo per fluorescenza. microscopia elettronica a trasmissione (TEM) può essere utilizzato anche per determinare se le particelle rimaste intatte dopo coniugazione.
- In breve, un microgrammo di nanoparticelle virale (in un volume finale di 2 mL) possono essere aggiunti alle reti in rame rivestito. Successivamente, aggiungere un uguale volume di acetato di uranile 2% per 1 minuto al microscopio elettronico (Philips EM 410).
3. Iniezione endovenosa di fluorescenza marcata con nanoparticelle virale
- Il Giorno 16, assemblare micro-iniettore come descritto sopra. Redigere il volume desiderato di nanoparticelle virale attraverso il tubo nella siringa (> 200 mL). Rimuovere con attenzione eventuali bolle d'aria. Inserire l'ago di vetro microiniezione alla fine del tubo. Assicurarsi che l'ago è lungo e affusolato possibile (Figura 2a). Se l'ago è troppo schietto, non sarà in grado di penetrare l'ectoderma e non riuscirà a penetrare il vaso. Se l'ago è troppo forte, la punta crollerà quando penetrare nei tessuti.
- Per via endovenosa iniettare 100 ml di 1 mg / ml di fluoresceina destrano (70.000 MW Da, Invitrogen) in embrione cuscinetto tumore distale dal sito desiderato da visualizzare (Figura 3d). Cannulazione successo della vena CAM è evidente dalla compensazione di sangue nel percorso del flusso di iniezione (Figura 2b). Valutare vascolare perdita 1 ora dopo l'iniezione.
- Iniettare per via endovenosa 50 ml di 1 mg / ml di soluzione di CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) o pegilato CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) in embrioni contenenti i tumori con perdite vascolari distali dal sito desiderato essere visualizzati.
- Tumori immagine subito e ogni ora dopo l'iniezione utilizzando un microscopio Zeiss Examiner Z1 verticale dotata di un disco di Yokogawa filatura, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD.
4. In tempo reale intravitale di imaging
- Per assemblare l'unità di riproduzione embrione, applicare un sottile strato di grasso per vuoto attorno alla circonferenza del porto di imaging sul lato inferiore del coperchio della fotounità embrione, e si adattano a 18 mm di vetro coprioggetto sul porto.
- Posizionare l'embrione in modo che il coprioggetto coprirà l'area desiderata per l'imaging. Abbassare lentamente il coperchio fino a quando il coprioggetto fa solo contatto con l'embrione, e quindi avvitare il coperchio sull'unità per tenerlo in posizione (Figura 2c).
- Aggiungere acqua riscaldata a 37 ° C all'interno dell'unità embrione di imaging fuori del piatto che contiene l'embrione, e poi si porta il complesso sulla scena di un microscopio confocale verticale con la camera interna ambientali equilibrati a 37 ° C.
- Posizionare l'unità di riproduzione che contiene l'embrione sotto il microscopio a fluorescenza Spinning disco confocale (Figura 2 sexies). L'unità imaging terrà l'embrione al suo posto e tenere il campo visivo durante l'acquisizione di immagini fisse, consentendo sia tridimensionale stack Z e time-lapse immagini da catturare. Noi acquisire e analizzare tridimensionale time-lapse immagini utilizzando Perkin Elmer (ex Improvvisazione) pacchetto software Volocity (Figura 3a). Acquisire ad alta risoluzione tridimensionale pila di vascolarizzazione del tumore e circostanti per visualizzare detailed analisi strutturale a specifici tempi punti. Acquisire tridimensionale pile a intervalli regolari di tempo i punti di mappa dettagliata dei cambiamenti strutturali nel sistema vascolare del tumore. Tumori immagine ogni ora dopo l'iniezione.
- Quantificare l'assorbimento delle nanoparticelle virale calcolando la media Alexa Fluor (AF) 647 del segnale all'interno di regioni selezionate nel tumore o nello stroma (non tumorali zona) software per immagini utilizzando la quantificazione come Volocity (Perkin Elmer). Il tumore al rapporto stroma è stato calcolato dividendo la media AF 647 segnale nel tumore oltre la media AF 647 segnale nello stroma. Un tumore / stroma rapporto superiore a 1 indica che la nanoparticella è stato preso dal tumore.
5. Rappresentante dei risultati:
Nell'esempio qui descritto, abbiamo iniettato le cellule HT-29 cancro al colon a formare un bolo di circa 1 mm di grandezza entro il giorno 9 CAM di embrioni di pollo (Figura 1b). Dopo l'inoculazione, gli embrioni sono stati coltivati per 7 giorni in un incubatore umidificato per consentire una crescita sufficiente e la vascolarizzazione del tumore (Figura 1c). Gli embrioni sono stati iniettati per via endovenosa con un peso di destrano a basso molecolare per confermare vascolarizzazione del tumore, ei tumori sono stati visualizzati al microscopio Zeiss AxioExaminer Z1 verticale (Figura 2d).
Dopo somministrazione endovenosa di CPMV-AF 647 o CPMV-PEG-AF 647 nanoparticelle (Figura 3a e b), ad alta risoluzione in tempo reale di imaging confocale (Figura 2 sexies) ha rivelato che sia CPMV e CPMV-PEG nanoparticelle rapidamente etichettato l'intero sistema vascolare, ma l'assorbimento di CPMV-PEG da parte del tumore è stata di circa 3 volte superiore CPMV dopo 12 ore (Figura 3a). L'assorbimento relativo di tumore nanoparticelle è stata determinata utilizzando software per l'analisi dell'immagine (Volocity da Perkin Elmer). Regioni di interesse sono stati selezionati all'interno e all'esterno del tumore (nel vano stromali) e l'intensità media di fluorescenza di ogni stato determinato. I dati vengono espressi come tumore / stroma rapporto.
Figura 1. Microiniezione dei tumori nel CAM di un embrione aviaria. (A) L'apparecchio microiniezione viene assemblata dai componenti, come indicato. (B) gli embrioni aviaria al giorno 9 sono pronti per essere inoculati con tumore quando la CAM si è diffusa per coprire l'intera superficie. (C) Al giorno 16, il tumore è cresciuto fino a 1 cm di diametro (linea tratteggiata) ed è pronto per l'iniezione di nanoparticelle.
Figura 2. Iniezione di nanoparticelle e di imaging intravitale. Iniezione sotto un microscopio che mostra la dissezione (a) la punta dell'ago microinjector pronto per essere iniettato nella vena CAM e (b) l'ago microinjector inserito nella vena (indicato dalla freccia) e nanoparticelle iniettate nel flusso sanguigno (visto da compensazione di sangue). (C) Imaging unit contenente embrione aviaria con il coprioggetto interfacciato direttamente con il CAM. (D) Prima dell'iniezione nanoparticelle, vascolarizzazione tumorale viene valutata utilizzando l'imaging intravitale dopo l'iniezione di fluorescina destrano. (E) Imaging unit contenente l'embrione posizionato sul palcoscenico di un microscopio confocale in posizione verticale all'interno di una temperatura regolata impostata recinto a 37 ° C.
Figura 3. Visualizzazione intravitale di assorbimento delle nanoparticelle nei tumori umani. I tumori sono visualizzate 7 ore dopo l'iniezione di (a) CPMV-AF647 e (b) CPMV-PEG-AF647. d) Escissione del tumore dall'embrione aviaria per successive analisi.