Questo studio descrive la diagnosi dell'influenza aviaria nei volatili selvatici utilizzando un portatile rRT-PCR sistema. Il metodo si avvale di liofilizzati reagenti per lo screening degli uccelli selvatici in un non-laboratorio di impostazione, tipica di uno scenario di un'epidemia. L'uso di strumenti molecolari fornisce alternative accurata e sensibile per la diagnosi rapida.
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Articolo metodologico
La diagnosi rapida del virus dell'influenza aviaria nei volatili selvatici: l'uso di un Portable rRT-PCR e liofilizzato reagenti nel campo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli uccelli selvatici sono stati implicati nella diffusione dell'influenza aviaria altamente patogena (HPAI) del sottotipo H5N1, spingendo la sorveglianza lungo le rotte migratorie. Campionamento degli uccelli selvatici di virus dell'influenza aviaria (AIV) è spesso condotto in regioni remote, ma i risultati sono spesso in ritardo a causa della necessità di trasportare i campioni a un laboratorio attrezzato per i test molecolari. In tempo reale della trascrittasi inversa reazione a catena della polimerasi (RRT-PCR) è una tecnica molecolare che offre uno dei metodi più accurati e sensibili per la diagnosi di AIV. I protocolli di laboratorio precedentemente indispensabile per rRT-PCR sono ora adattato per il campo. Sviluppo di reagenti liofilizzati (liofilizzato) che non richiedono catena del freddo, con sensibilità a livello di reagenti bagnato ha portato il collaudo in loco remoto ad un obiettivo pratico.
Qui vi presentiamo un metodo per la diagnosi rapida di AIV nei volatili selvatici utilizzando un rRT-PCR unità (Ruggedized Advanced Device identificazione dei patogeni o RAPID, Tecnologie Idaho, Salt Lake City, UT), che impiega reagenti liofilizzati (Influenza A Obiettivo 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Tecnologie Idaho). I reagenti contengono tutti i componenti necessari per il test a concentrazioni appropriate in un unico tubo: primer, sonde, enzimi, tamponi interni e controlli positivi, eliminando gli errori associati alla conservazione impropria o la manipolazione di reagenti bagnato. L'unità portatile esegue uno schermo per l'influenza A colpire il gene matrice rendimenti e dei risultati in 2-3 ore. Tipizzazione genetica è possibile anche con innesco H5 e H7 fissa che colpiscono il gene emoagglutinina.
Il sistema è adatto per l'uso su campioni cloacali e orofaringeo raccolti da uccelli selvatici, come dimostrato qui sulla specie migratrice shorebird, il piro-piro occidentale (Calidrus mauri) catturato nel nord della California. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati Uniti Uccello Banding laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di accelerare la diagnosi degli uccelli selvatici, aumentando le probabilità di contenere un focolaio in una postazione remota. Sul posto la diagnosi sarebbe rivelarsi utile anche per individuare e studiare gli individui infetti nelle popolazioni selvatiche. La possibilità di raccogliere informazioni sulla biologia dell'ospite (risposta immunologica e fisiologica alle infezioni) e l'ecologia spaziale (prestazioni migratorie degli uccelli infetti) fornirà intuizioni sulla misura in cui gli uccelli selvatici possono fungere da vettori per AIV su lunghe distanze.
Protocollo
1. La cattura di uccelli selvatici con reti mist
- Per la cattura shorebird, istituito reti nebbia in un sito attivo foraggiamento come una palude, litorale, o fango piatto.
- Far scorrere la linea tramagli anelli di una delle estremità della rete nebbia attorno al palo e inserire palo verticalmente nel fango.
- Stendi la rete, inserire il secondo polo attraverso cicli tramagli all'altra estremità della rete di nebbia e verticalmente inserire palo in fango, assicurandosi che le linee tramaglio viene insegnato.
- Una volta un uccello viene catturato, estrarre l'uccello dalla rete e tornare alla stazione di bande.
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Discussione
Il metodo di diagnosi rapida qui presentati facilita test rapido ed accurato di campioni di uccelli selvatici per la sorveglianza di AIV. Il tanto meno severi requisiti campione di storage portatili rRT-PCR sono adatti per le situazioni in cui la manutenzione a distanza di una catena del freddo può essere impraticabile se spedizionieri azoto liquido o ghiaccio secco non è disponibile. Inoltre, abbiamo riscontrato che l'analisi del campione con i reagenti liofilizzati era abbastanza semplici per essere eseguite da bi.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare M. Scullion e R. Crisp delle Tecnologie Idaho per il supporto tecnico e la USGS occidentale Centro di Ricerca Ecologica per il finanziamento (S. Schwarzbach) e assistenza (K. Spragens, T. Graham). Questa ricerca è stata effettuata sotto l'egida del Centro per la Tecnologia Innovativa - Istituto per la Difesa e Sicurezza Nazionale (www.idhs.org), a sostegno del Dipartimento della Difesa e Air Force Research Laboratory. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| RNeasy mini rotazione della colonna | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| Provette di raccolta (1,5 e 2 ml) | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| RNasi-free acqua | Qiagen | 74106 | Incluso nel kit RNeasy Mini |
| 14,3 M β-mercaptoetanolo soluzione | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% di etanolo | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Settori scientifico | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Obiettivo 1 (Sonda idrolisi) | Idaho Technologies | Asay-ASY-0109 | |
| LightCycler tubi capillari 20ml | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuga con rotore per 2 ml provette | Idaho Technologies | Incluso nel kit RAPID | |
| Ruggedized Advanced Device identificazione dei patogeni (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Incluso nel kit RAPID | |
| Pentium portatile con Windows XP Professional | Idaho Technologies | Incluso nel kit RAPID | |
| LightCycler Analisi dei dati del software | Idaho Technologies | Incluso nel kit RAPID |
Riferimenti
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
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Ristampe e permessi
