Il nostro esperimento mostra come eseguire una analisi di sequenziamento di specie batteriche translocating nel sangue periferico di pazienti HIV positivi.
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Articolo metodologico
Sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da HIV
In questo articolo
Sommario
Abstract
La salute del tratto gastrointestinale è fisiologicamente colonizzate da una grande varietà di microbi commensali che influenzano lo sviluppo del umorale e cellulare 1,2 mucose del sistema immunitario.
Microbiota è protetta dal sistema immunitario attraverso una forte barriera mucosale. Infezioni e antibiotici sono noti per alterare la barriera sia normale tratto gastrointestinale e la composizione dei batteri residenti, che può causare possibili anomalie immunitarie 3.
HIV provoca una breccia nella barriera gastrointestinale con insufficienza progressiva di immunità mucosale e perdite nella circolazione sistemica di bioprodotti batteriche, come lipopolisaccaride e frammenti di DNA batterico, che contribuiscono ad attivazione immunitaria sistemica 4-7. Traslocazione microbica è implicato in HIV / AIDS immunopatogenesi e risposta alla terapia 4,8.
Abbiamo voluto caratterizzare la composizione dei batteri translocating nel sangue periferico di pazienti affetti da HIV. Per perseguire il nostro scopo abbiamo istituito una reazione di PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric seguita da una analisi di sequenziamento.
In breve, il sangue intero da entrambi i soggetti con infezione da HIV e sano viene usato. Dato che gli individui sani presentano normale omeostasi intestinale non traslocazione della microflora è atteso in questi pazienti. Dopo il prelievo di sangue intero da prelievo venoso e la separazione del plasma, il DNA è estratto dal plasma e utilizzato per eseguire una vasta gamma di reazioni PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric 9. Seguenti analisi purificazione PCR prodotto, la clonazione e il sequenziamento vengono eseguite.
Protocollo
La manipolazione dei campioni di sangue con infezione da HIV richiede alcune importanti raccomandazioni.
Tutti i campioni di sangue devono essere trasportati in robusto perfetta tenuta. Si deve prestare attenzione al momento del ritiro del campione per evitare la contaminazione esterna del contenitore e di qualsiasi documentazione che accompagna il campione.
Tutte le persone che trasformano sangue infetto devono indossare guanti. I guanti devono essere cambiati e lavati le mani dopo il completamento del trattamento del campione.
Trattamento di infezione da HIV campioni di sangue deve essere fatto in un armadio di classe II cofano rischio biologico.
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Discussione
Con la presente mostra una PCR / sequenziamento del protocollo per caratterizzare la traslocazione di batteri nel sangue periferico di individui affetti da HIV.
I più affidabili si ottengono quando si usa plasma raccolto in EDTA contenenti tubi. Dopo il prelievo di sangue, plasma devono essere separati per centrifugazione entro 2 / 3 ore, per evitare emolisi e frammento di degradazione del DNA. I campioni vengono conservati prima a -20 ° C per circa 5 giorni e poi a -80 ° C........
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati a Gianni Scimone di assistenza eccellente, con fare video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| Ultrapura Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lisozima | Fluka | 62970 | 10 mg / ml in acqua distillata |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystems | 26478701 | |
| Microcontrollore 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primer | Invitrogen | ||
| Agarosio | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| Agar LB, polvere | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillina | Invitrogen | 11593027 | 10 mg / ml in acqua distillata |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in acqua distillata |
| Topo TA clonazione kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink rapida kit Miniprep plasmidi | Invitrogen | K210010 | |
| Big colorante | Applied Biosystems | 4337455 | |
| DyeEx 2,0 rotazione kit | Qiagen | 63204 |
Riferimenti
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Na....
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Ristampe e permessi
