Vi presentiamo il protocollo dettagliato per Agrobacterium mediata indotta da virus silenziamento genico (VIGS), saggio in cotone. Il virus crepitio del tabacco (TRV)-vettori derivati VIGS sono stati schierati per indurre il silenziamento dell'RNA di cotone GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. Il fenotipo albino causati da tacere GrCLA1 è stata osservata nella fase piantina entro 2 settimane dopo l'inoculazione.
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Articolo metodologico
Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cotone (Gossypium hirsutum) è una delle colture più importanti del mondo. Notevoli sforzi sono stati fatti sulla riproduzione molecolare di nuove varietà. La grande analisi del gene funzionale in cotone è stato ritardato dietro la maggior parte delle specie vegetali moderna, probabilmente dovuto alle sue grandi dimensioni del genoma, duplicazione genica e poliploidia, ciclo di crescita a lungo e recalcitrante alla trasformazione genetica 1. Per facilitare un elevato throughput studio funzionale genetica / genomica in cotone, cerchiamo di sviluppare analisi transienti rapidi ed efficaci per valutare le funzioni del gene cotone.
Virus-Induced silenziamento genico (VIGS) è una tecnica potente che è stato sviluppato in base all'host post-trascrizionale silenziamento genico (PTGS) per reprimere la proliferazione virale 2,3. Mediata da Agrobacterium VIGS è stato applicato con successo in una vasta gamma di specie dicotiledoni come Solanacee, specie Arabidopsis e legumi, e specie tra monocotiledoni orzo, frumento e mais, per vari studi di genomica funzionale 3,4. Dato che questo approccio rapido ed efficiente evita la trasformazione delle piante e supera ridondanza funzionale, è particolarmente interessante e adatto per lo studio genomica funzionale in specie vegetali come il cotone non suscettibili di trasformazione.
In questo studio, riportiamo il protocollo dettagliato di Agrobacterium mediata dal sistema VIGS in cotone. Tra i diversi vettori virali VIGS, il virus sonaglio tabacco (TRV) invade una vasta gamma di ospiti ed è in grado di diffondere con forza in tutto l'intero impianto ancora produrre sintomi lievi sul hosts5. Per monitorare l'efficienza di silenziamento, GrCLA1, un gene omologo di Cloroplastos Arabidopsis alterados 1 gene (AtCLA1) in cotone, è stato clonato e inserito nel binario VIGS vettore pYL156. CLA1 gene è coinvolto nello sviluppo cloroplasti 6, e studi precedenti hanno dimostrato che perdita di funzione di AtCLA1 portato ad un fenotipo albino sulle foglie vere 7, fornendo un eccellente marcatore visivo per far tacere l'efficienza. A circa due settimane dopo l'infiltrazione Agrobacterium, il fenotipo albino iniziato a comparire sulle foglie vere, con un'efficienza di silenziamento del 100% in tutti gli esperimenti replicati. Il silenziamento dei geni endogeni è stato confermato anche da analisi RT-PCR. Significativamente, mettendo a tacere potentemente potrebbe verificarsi in tutte le cultivar che abbiamo provato, tra cui diverse varietà coltivate commercialmente in Texas. Questo rapido ed efficiente mediata da Agrobacterium test VIGS fornisce uno strumento molto potente per una rapida analisi su larga scala delle funzioni dei geni a livello di genoma in cotone.
Protocollo
1. Crescere piantine di cotone
- Gettare i semi del cotone di montagna (Gossypium hirsutum) varietà Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR e Deltapine 90 in vasi (7 cm di diametro) contenente Mix Metro 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Conservare i vasi in un vassoio coperto con una cupola di plastica a 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 luce, con un fotoperiodo di 12 ore light/12 buia in una stanza di crescita.
- Rimuovere la cupola quando due cotiledoni sono emerse.
- Circa due settimane dopo, l'uso delle piante con due cotiledoni completamente sviluppati per il dosaggio VIGS. In questa fase, le foglie vere non sono ancora emerse (....
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Discussione
VIGS ha dimostrato di essere un potente strumento di analisi genomica funzionale da transitoriamente abbattendo l'espressione di geni endogeni. In questo studio, abbiamo sviluppato un mediata da Agrobacterium VIGS utilizzando un TRV-vettoriale binario. Il cotone CLA1 (GrCLA1) gene è stato sviluppato come marcatore visivo per monitorare l'efficienza tacere. Abbiamo sempre ottenuto il 100% di efficienza silenziamento genico, dimostrato dal fenotipo albino che appaiono sulle foglie vere in tutte le varietà.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati a Drs. SP-Dinesh Kumar e Yule Liu per TRV-VIGS vettori, e Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr e Bayer CropScience per la fornitura di semi di cotone. Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF per LS e NIH di PH
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome dei reagenti e attrezzature | Azienda | Catalogo / Numero di serie | Commenti |
| Rullo di tamburo | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-batterio della cultura |
| Incubatrice | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-batterio della cultura |
| UV / Vis spettrofotometro | Beckman Coulter | Modello: DU530 | Delle DO |
| Gene Pulser | BioRad | Modello: 1652076; di serie: 154BR3880 | Elettroporazione |
| Pulser controller | BioRad | Modello: 1652098; di serie: 232BR4833 | Elettroporazione |
| Micropulser Elettroporazione cuvetta | BioRad | 165-2081 | Elettroporazione |
| 1 ml siringa | BD Biosciences | 30962 | Inoculazione di agro-batterio |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU # 553001 | Piantina in crescita |
| Terra Cotta pentola | TOPlastics | GPS 3001B2 | Piantina in crescita |
| MES monoidrato | USB | 18886 | Infiltrazione tampone |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltrazione tampone |
Riferimenti
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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Ristampe e permessi
