Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Sommario

Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale In vivo.

Abstract

Sviluppo di un circuito preciso olfattivo si basa sulla proiezione accurata dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) assoni ai loro bersagli sinaptici nel bulbo olfattivo (OB). I meccanismi molecolari della crescita degli assoni OSN e targeting non sono ben compresi. L'espressione genica e la successiva manipolazione di visualizzazione degli assoni OSN singoli e la loro morfologia terminale pergolato finora sono stati difficili. Per studiare la funzione dei geni a livello di singola cellula all'interno di un periodo di tempo specificato, abbiamo sviluppato una tecnica basata lentivirale per manipolare l'espressione genica in OSNs in vivo. Particelle lentivirali sono consegnati a OSNs dalla microiniezione nell'epitelio olfattivo (OE). Cassette di espressione sono poi definitivamente integrata nel genoma di OSNs trasdotte. Espressione della proteina fluorescente verde identifica OSNs infetti e delinea la loro morfologia, inclusi il terminale assone pergolato. A causa del tempo di risposta brevi tra microiniezione e la rilevazione giornalista, studi di funzione del gene può essere concentrato in un periodo molto ristretto di sviluppo. Con questo metodo, abbiamo rilevato espressione GFP all'interno da un minimo di tre giorni e fino a tre mesi dopo l'iniezione. Abbiamo raggiunto entrambi over-espressione e shRNA mediata knock-down da microiniezione lentivirali. Questo metodo fornisce morfologie dettagliate di corpi cellulari OSN e assoni a livello di singola cellula in vivo, e permette quindi la caratterizzazione della funzione del gene candidato durante lo sviluppo olfattivo.

Protocollo

1. Preparazione

Questa procedura è biosicurezza di livello 2, quindi tutti i preparativi sono apportate le seguenti in una cappa rischio biologico in cui si svolge la procedura di microiniezione.

1. Preparare e preriscaldare a 37 ° C ad acqua: Riempire un sacchetto di plastica con acqua di stoccaggio - tenuta e impostare su un svuotato riscaldamento blocco incubatore. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l'iniezione.
2. Riempire un contenitore di rischio biologico dei rifiuti con il 10% di candeggina per un volume adatto per immersione di tutti i rifiuti da questa procedura.
3. Preparare un piatto pic....

Discussione

Microiniezione di risultati lentivirus in trasferimento definitivo di costrutti del gene nel DNA genomico OSN. Questo approccio ci permette di eseguire manipolazioni a breve termine oa lungo termine di geni candidati attraverso l'iperespressione o mediata shRNA knock-down. Inoltre, siamo in grado di fluorescenza etichetta OSNs singolo in una linea esistente topo transgenico per osservare co-localizzazione delle popolazioni di recettore olfattivo. Microiniezione è necessaria per la trasduzione lentivirale di OSNs. Ab.......

Materiali