Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Sommario

Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale In vivo.

Abstract

Sviluppo di un circuito preciso olfattivo si basa sulla proiezione accurata dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) assoni ai loro bersagli sinaptici nel bulbo olfattivo (OB). I meccanismi molecolari della crescita degli assoni OSN e targeting non sono ben compresi. L'espressione genica e la successiva manipolazione di visualizzazione degli assoni OSN singoli e la loro morfologia terminale pergolato finora sono stati difficili. Per studiare la funzione dei geni a livello di singola cellula all'interno di un periodo di tempo specificato, abbiamo sviluppato una tecnica basata lentivirale per manipolare l'espressione genica in OSNs in vivo. Particelle lentivirali sono consegnati a OSNs dalla microiniezione nell'epitelio olfattivo (OE). Cassette di espressione sono poi definitivamente integrata nel genoma di OSNs trasdotte. Espressione della proteina fluorescente verde identifica OSNs infetti e delinea la loro morfologia, inclusi il terminale assone pergolato. A causa del tempo di risposta brevi tra microiniezione e la rilevazione giornalista, studi di funzione del gene può essere concentrato in un periodo molto ristretto di sviluppo. Con questo metodo, abbiamo rilevato espressione GFP all'interno da un minimo di tre giorni e fino a tre mesi dopo l'iniezione. Abbiamo raggiunto entrambi over-espressione e shRNA mediata knock-down da microiniezione lentivirali. Questo metodo fornisce morfologie dettagliate di corpi cellulari OSN e assoni a livello di singola cellula in vivo, e permette quindi la caratterizzazione della funzione del gene candidato durante lo sviluppo olfattivo.

Protocollo

1. Preparazione

Questa procedura è biosicurezza di livello 2, quindi tutti i preparativi sono apportate le seguenti in una cappa rischio biologico in cui si svolge la procedura di microiniezione.

1. Preparare e preriscaldare a 37 ° C ad acqua: Riempire un sacchetto di plastica con acqua di stoccaggio - tenuta e impostare su un svuotato riscaldamento blocco incubatore. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l'iniezione.
2. Riempire un contenitore di rischio biologico dei rifiuti con il 10% di candeggina per un volume adatto per immersione di tutti i rifiuti da questa procedura.
3. Preparare un piatto piccolo aperto di etanolo al 70% e un secondo piatto con ddH2O sterilizzato e posto nella cabina di sicurezza biologica.
4. Sterilizzare una siringa 5μL capacità di Hamilton con una 33-gauge a spruzzo discendono lungo il corpo ago con etanolo al 70% con lo stantuffo tirato fuori tutta la strada. Ripetutamente aspirare etanolo dal piatto ed espellere tutta la strada fuori almeno 5 volte.
5. Lavare la cartuccia siringa aspirando e espellendo acqua sterile almeno 5 volte. Luogo siringa in modo sicuro da parte nel cofano della cultura e lasciarlo asciugare.
6. Rimuovere le scorte virale da -80 ° C e magazzini frigoriferi, posto sul ghiaccio per consentire lo scongelamento. Microiniezione richiede 2μL di azioni virali per il mouse ad un titolo di 10 ⁹ unità infettive / mL. Lentivirus possono essere ottenute da fonti commerciali o prodotte in laboratorio secondo il protocollo stabilito (Lois et al., 2002).
7. Preparare una fase di iniezione che prevede una zona rialzata rispetto la superficie del cofano - può utilizzare una capsula di Petri 10 centimetri coperta con un foglio di Kimwipe.
8. Disporre cotone imbevuto di alcol nei pressi della stazione di iniezione.

2. Microiniezione di particelle lentivirali nell'epitelio olfattivo

Tutte le procedure di animali effettuati in questo metodo sono fatto in base alle linee guida approvate IACUC. Il Mus musculus ceppo C57BL/6J è il modello animale utilizzato in tutti gli esperimenti hanno dimostrato qui.

1. Anestetizzare cuccioli di topo da ipotermia prendendo un topo cucciolo (P0-P3) fuori dalla gabbia e mettendo il cucciolo su un taglio aperto guanto in ghiaccio per 5 minuti.
2. In attesa che il cucciolo di essere completamente anestetizzato, 2μL aspirato di magazzino virale nella siringa sterilizzata Hamilton.
3. Posizionare il mouse cucciolo in cima alla fase di iniezione. Tirare delicatamente la pelle dalla parte superiore della testa all'orecchio verso la parte superiore del collo. Questo dovrebbe fornire una superficie cutanea insegnato nel corso della cavità nasale e la facilità di iniezione.
4. Inserire l'ago attraverso la parte superiore della cavità nasale circa 3 mm sotto la superficie della pelle per raggiungere l'epitelio olfattivo. Microinject 0.5μL di soluzione antivirus per colpo, la scelta di due siti per lato, sinistro e destro (quattro iniezioni totale per il mouse = 2μL di virus necessaria). Siti di iniezione devono essere sfalsati l'uno dall'altro. Per il targeting dei siti d'iniezione appropriate, cercare la superficie dorsale del cranio per il contorno del bulbo olfattivo. Questa linea è appena visibile alla nascita attraverso la semi-trasparente la pelle e il cranio. Per fare due iniezioni per lato, mirano solo una iniezione rostrale ad una lampadina a delineare un asse mediale. Effettuare l'inserimento seconda laterale alla struttura lampadina, ma assicurarsi di angolo l'iniezione medialmente in modo che si può raggiungere l'epitelio olfattivo che si trova ventralmente sotto il bulbo. Evitare di penetrare il bulbo olfattivo!
5. Asciugare qualsiasi soluzione residua virus o del sangue che possono sfuggire dal sito di iniezione o aperture con una narice Kimwipe. Disporre immediatamente di Kimwipes nel contenitore candeggina diluita rischio biologico.
6. Posizionare il mouse iniettato sul letto ad acqua incubatrice.
7. Ripetere i passaggi 1-4 per tutti i mouse da iniettare, ricordando che avrà bisogno di circa 2μL di azioni virali per il mouse.
8. Lasciate che i topi recuperare sulle incubatore letto ad acqua per 30 minuti prima di tornare al loro gabbia originale nidificazione.
9. Smaltire fase microiniezione, salviette igienizzanti e prodotti di carta qualsiasi ulteriore pulizia nello smaltimento candeggina rischio biologico.
10. Pulire la siringa Hamilton da ripetuti aspirazione ed espulsione di etanolo e acqua come fatto nelle fasi di preparazione. Lasciare la siringa ad asciugare.
11. Per la massima efficienza di trasduzione ripetere questa procedura di nuovo in 4 ore. OSNs infetto può essere visualizzato per tutta la lunghezza della cellula in meno di tre giorni.

3. Immunoistochimica di galleggianti sezioni bulbo olfattivo

1. Sacrificare il mouse iniettati nel punto in tempo desiderato e perfusione fissare il tessuto con il 4% paraformaldeide. Sezionare la OB. Incubare in paraformaldeide notte e il 30% di saccarosio in PBS durante la notte. Incorporare nel mezzo di inclusione ottobre in ghiaccio secco.
2. Coronale sezioni OB si ottengono con una 60μm di spessore utilizzando un criostato. Sweep sezioni lampadina in un piatto di 10 centimetri cultura con 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Sezioni devono essere tenuti galleggianti in PBS per consentire ottobre a dissolve. Trasferimento sezioni galleggianti e PBS in una fiala 50mL conica.
3. Consentono di fare tappe di depositarsi sul fondo della fiala. Aspirare PBS senza succhiare tutte le sezioni. Sciacquare sezioni di tessuto con 20 mL di PBS. Ripetere regolare e passi l'aspirapolvere. Tessuto Risospendere con 10 ml di PBS e sezioni trasferimento galleggianti in una fiala da 15 ml conica per immunocolorazione. Una volta sezioni di tessuto si sono stabiliti, aspirare PBS surnatante senza disturbare i tessuti. Sezioni Risospendere con 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) che consente detergente per perforare le membrane cellulari. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e ripetere l'incubazione con PBS-Tx due volte.
4. Incubare sezioni di tessuto in 10 ml di soluzione bloccante (siero di cavallo al 5% in PBS-Tx) per due ore a temperatura ambiente.
5. Soluzione di risciacquo bloccare almeno due volte con PBS-Tx per 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Preparare 2 ml di una soluzione di anticorpo primario in PBS-Tx. Reagenti e vedere sezione Attrezzature per gli anticorpi utilizzati in questo esperimento.
7. Sostituire il secondo PBS-Tx lavare il blocco con una soluzione di anticorpo primario. Incubare su una piattaforma lentamente a dondolo (~ 30rpm) a 4 ° C per 24-48 ore per permettere una buona penetrazione nelle sezioni 60μm galleggiante.
8. Dopo l'incubazione, la soluzione di anticorpo primario può essere recuperata con attenzione con una pipetta e conservato a 4 ° C per il riutilizzo fino a due volte nel giro di due settimane senza una significativa perdita di intensità della colorazione.
9. Lavare le sezioni per tre volte in PBS-Tx per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente con rotazione dolce (~ 30rpm).
10. Preparare 2 ml di diluizione anticorpo secondario in PBS-Tx. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione secondaria di anticorpi a sezioni di tessuto. Avvolgere la parte esterna della fiala colorazione foglio d'alluminio per bloccare la luce, che può causare photobleaching fluoroforo. Luogo avvolto flaconcino su una piattaforma lentamente a dondolo e incubare a 4 ° C durante la notte.
11. Scartare la soluzione secondaria di anticorpi con un aspirapolvere distanza. Lavare le sezioni una volta con PBS-Tx per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare altre due volte con PBS (pH 7,4) per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Montare le sezioni di tessuto su vetrini colorati con Fluoromount G.
12. Schermo attraverso sezioni colorate per gli assoni OSN positivamente infetti e termini assone con un microscopio a fluorescenza.
13. Per costruire una vista tridimensionale di un marcato OSN assone e terminale pergolato, effettuare una serie di sezioni ottiche attraverso la profondità 60μm della porzione obiettivo tessuto OB (lungo l'asse z) usando la microscopia confocale.
14. Questa pila di Z-sezione immagini possono poi essere proiettate insieme per ricostruire una prospettiva a 360 ° di rotazione di una singola etichetta OSN assone, tra cui dettaglio terminale pergolato nella sua interezza. Uno qualsiasi angolo di rotazione singoli possono essere catturati ed esportati come file immagine (es. JPG, TIFF) per la presentazione in formato 2D.

4. Rappresentante Risultati

Con i metodi descritti qui, siamo in grado di trasdurre neuroni sensoriali olfattivi da lentivirus in vivo. Abbiamo così lontano OSNs visualizzati infettati con GFP e reporter mCherry fluorescenti, e con un myc-tag proteina di fusione mediante immunocitochimica. Questa tecnica offre una grande varietà di OSNs infetti. Eppure, trasduzione avviene sporadicamente abbastanza per fornire OSNs etichettate singolarmente, consentendo così l'analisi della morfologia delle cellule singole. Assoni e dei terminali degli assoni sono esposte all'interno di sezioni di tessuto OB in mezzo ai loro ambiente nativo di microscopia confocale (Figura 1). L'intero OSN assone terminale pergolato in genere può essere catturato all'interno di un 40-50 micron sezione ottica. Alto ingrandimento infetti terminali degli assoni OSN consente un'analisi dettagliata dei assonale morfologia pergolato a livello glomerulare.

Figura 1. Traiettoria del singolo neurone olfattivo sensoriale assonale e il suo terminale pergolato. A) una sezione coronale del bulbo olfattivo di un mouse P7 che mostra il livello del nervo olfattivo (ONL) immunostained per OMP (rosso) e lo strato glomerulare (GL) immunostained sia con OMP e Vglut2 (grigio). Un singolo assone dei neuroni sensoriali olfattivi che esprimono GFP (verde) viaggia all'interno della ONL e penetra nella struttura glomerulare. B) L'assone terminale morfologia pergolato all'interno del glomerulo chiaramente evidenziato dalla espressione di GFP. Vglut2 co-colorazione in grigio illumina la superficie totale glomular entro il quale la GFP-positive assone elabora un ABOR terminale. C) lentivirali OSNs infetti che esprimono GFP (verde) in OE. Il cytostructure dell'epitelio olfattivo è mostrato con colorazione DAPI (blu). Espressione GFP permette la visualizzazione di corpi cellulari OSN e il loro processi cellulari in OE. D) Un assone OSN e la sua morfologia terminale con Rap1GAP2 espressione knock-down di shRNA. Lentivirus portando una cassetta a doppia espressione con Rap1GAP2 shRNA sotto il promotore del mouse U6 e GFP sotto unPromotore CMV sono stati applicati alla OE. Infetti terminali degli assoni olfattivi mostrato una più semplice terminale pergolato rispetto a quella del controllo GFP solo. Bar = 20μm.

Discussione

Microiniezione di risultati lentivirus in trasferimento definitivo di costrutti del gene nel DNA genomico OSN. Questo approccio ci permette di eseguire manipolazioni a breve termine oa lungo termine di geni candidati attraverso l'iperespressione o mediata shRNA knock-down. Inoltre, siamo in grado di fluorescenza etichetta OSNs singolo in una linea esistente topo transgenico per osservare co-localizzazione delle popolazioni di recettore olfattivo. Microiniezione è necessaria per la trasduzione lentivirale di OSNs. Ab...

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