Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l'ultima generazione di software di analisi di immagine.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis
In questo articolo
Sommario
Abstract
OHC sono cilindriche cellule sensomotorio trova l'organo del Corti, l'organo uditivo all'interno dell'orecchio interno dei mammiferi. Il nome "cellule ciliate" deriva dal loro caratteristico fascio apicale di stereociglia, un elemento critico per la rilevazione e trasduzione di energia sonora 1. OHC sono in grado di cambiare forma-allungare, accorciare e piegare-in risposta alla stimolazione elettrica, meccanica e chimica, una risposta motoria considerato cruciale per l'amplificazione di segnali acustici cocleari 2.
Stimolazione OHC induce due risposte diverse mobili: i) electromotility, alias motilità veloce, variazioni di lunghezza nel range microsecondo derivati da cambiamenti conformazionali a trazione elettrica in proteine motrici densamente OHC nella membrana plasmatica, e ii) la motilità lenta, cambia forma nel millisecondi a secondi gamma di riorganizzazione del citoscheletro 2, 3. OHC flessione è associato con electromotility, e il risultato sia da una distribuzione asimmetrica delle proteine motrici nella membrana plasmatica laterale, o asimmetrica stimolazione elettrica di queste proteine motore (ad esempio, con un campo elettrico perpendicolare all'asse lungo delle cellule) 4. Stimoli meccanici e chimici inducono risposte mobili essenzialmente lento, anche se i cambiamenti nelle condizioni ionico delle cellule e / o del loro ambiente può anche stimolare la membrana plasmatica-embedded proteine motrici 5, 6. Dal momento che le risposte OHC mobili sono una componente essenziale dell'amplificatore cocleare, l'analisi qualitativa e quantitativa di queste risposte mobili a frequenze acustiche (approssimativamente da 20 Hz a 20 kHz negli esseri umani) è una questione molto importante nel campo della ricerca dell'udito 7.
Lo sviluppo della nuova tecnologia di imaging ad alta velocità che unisce telecamere, sistemi basati su LED di illuminazione e sofisticati software di analisi dell'immagine offre ora la possibilità di eseguire qualitativo affidabile e studi quantitativi della risposta mobili di OHC isolato in un campo elettrico alternato esterno (EAEF) 8. Questa è una tecnica semplice e non invasivo che aggira la maggior parte dei limiti degli approcci precedenti 9-11. Inoltre, il LED basato su sistema di illuminazione fornisce luminosità estrema con insignificanti effetti termici sui campioni e, per l'uso della microscopia video, risoluzione ottica è di almeno 10 volte più alta rispetto alle tradizionali tecniche di microscopia ottica 12. Ad esempio, con l'impostazione sperimentale descritta qui, variazioni di lunghezza delle cellule di circa 20 nm, possono essere regolarmente rilevati e affidabile a frequenze di 10 kHz, e questa risoluzione può essere ulteriormente migliorati a frequenze più basse.
Siamo fiduciosi che questo approccio sperimentale contribuirà a estendere la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della motilità OHC.
Protocollo
1. Isolamento di OHC
- Iniziare questa procedura per la raccolta delle ossa temporali da cavie, topi o il vostro modello animale dei mammiferi.
- Quindi, aprire le ossa temporali utilizzando una pinza martello al fine di esporre la coclea, e immergile nella Leibovitz L-15. Togliere l'eccesso di osso con attenzione, mantenendo intatto il guscio osseo. Considerando che questa è una procedura generale applicabile alle ossa temporale di qualsiasi specie di mammiferi, piccole modifiche alla tecnica può essere necessaria quando si tratta di ossa temporali da animali molto piccoli. Negli animali vecchi della bolla di solito è calcificato, introducendo un'ul....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il metodo sperimentale presentato qui permette di valutare le risposte OHC mobili della gamma kHz senza alcuna restrizione al movimento della cellula. Protocolli di stimolazione differenti, altri marker (microsfere), come pure i cambiamenti nell'orientamento della cella con riguardo al campo elettrico, permettono di indagare nuovi aspetti della motilità OHC con un livello di dettaglio precedentemente inaccessibili. Altri metodi, ad esempio quelli che utilizzano fotodiodi 9 o laser Doppler vibrometria
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Lavoro supportato da National Institutes of Health sovvenzioni R01DC10146/R01DC010397, dell'NIDCD P30 DC006276 Core Research, e istituti di istruzione superiore. Il suo contenuto è esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o istituti di istruzione superiore. Gli autori dichiarano assenza di conflitto attuale o potenziale di interesse.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Leibovitz L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenasi (Tipo 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
Riferimenti
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
