Preparazione di organoidi dai tumori: un modello tumorale in vitro 3D

Le procedure sugli animali qui descritte sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Dipartimento delle Risorse Animali da Laboratorio, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.

NOTA: I topi maschi da sezionare per isolare la prostata o i tumori della prostata per la generazione di organoidi dovrebbero aver raggiunto almeno l'età della maturità sessuale - circa 8-10 settimane di età. L'età specifica dei topi può variare tra gli studi. Alcuni fattori da considerare nella scelta dell'età includono i cambiamenti dipendenti dall'età nelle popolazioni di cellule prostatiche, l'espressione dipendente dall'età di specifici transgeni Cre guidati dal promotore e il tasso di progressione del tumore alla prostata in un particolare GEMM.

NOTA: La Figura 1 mostra una descrizione illustrata della procedura per la generazione di organoidi tumorali.

1. Preparazione

1. Preparare il terreno organoide prostatico di topo secondo Drost et al. con le seguenti modifiche. Utilizzare un terreno condizionato al posto delle proteine ricombinanti per Noggin e R-spondina e utilizzare una concentrazione finale dell'1% (v/v), invece del 10%, sia per il terreno condizionato con Noggin che per quello con R-spondina><. NOTA: Le cellule HEK293 trasfettate stabilmente con HA-topo Noggin-Fc o HA-topo Rspo1-Fc sono utilizzate per produrre rispettivamente terreno condizionato con Noggin- o R-spondin-. Queste linee cellulari sono state un dono del Calvin Kuo Laboratory della Stanford University.
2. Preparare la soluzione di digestione in una provetta da 15 mL diluendo 20 mg/mL di collagenasi II con terreno Advanced DMEM/F12(+++) a una concentrazione finale di 5 mg/mL. Aggiungere l'inibitore della roccia Y-27632 alla soluzione di collagenasi II alla concentrazione finale di 10 μM.
   NOTA: Il rapporto tra tampone di digestione e tessuto è di 1 ml per 50 mg, che utilizziamo secondo Drost et al.

2. Tritatura e digestione del tessuto tumorale

1. Nella cappa di coltura cellulare, posizionare il tessuto tumorale prostatico in una piastra di coltura sterile di 10 cm, sezionare ed eliminare il tessuto necrotico.
2. Tritare il restante tessuto tumorale prostatico in cubi di 1 mm³ tenendo i pezzi di tessuto con la pinza curva sterile e tagliando con le forbici da dissezione.
3. Posizionare i pezzi di tumore tritati nella provetta da 15 ml con il tampone di digestione raccogliendoli con il lato curvo della pinza. Digerire il tessuto tumorale a 37 °C agitando per 1,5-2 ore. Controllare l'andamento della digestione ogni 20 min.
   NOTA: A questo punto, prelevare almeno 2 mL di matrice dalla conservazione a -20 °C e scongelare con ghiaccio. 1 mL di aliquote di matrice impiegherà circa 3 ore per scongelarsi.
4. Dopo la digestione dei tessuti, centrifugare la provetta a 175 x g per 5 minuti a 4 °C per formare un pellet cellulare.
5. Rimuovere il surnatante, muovere il tubo per allentare il pellet cellulare e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tripsina preriscaldata integrata con 10 μM di Y-27632 Rock Inhibitor. Mettere il tubo in un bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
6. Dopo l'incubazione, pipettare su e giù 5 volte con un puntale P1000 standard. Riportare il tubo a bagnomaria a 37 °C per altri 5 minuti e ripetere il passaggio 2.6.
   NOTA: A questo punto della procedura, riscaldare una piastra sterile per colture cellulari a 6 pozzetti mettendola in un'incubatrice a 55 °C.

3. Conteggio delle cellule e risospensione in matrice

1. Lavare le cellule aggiungendo 9 mL di AdDMEM/F12 (+++) freddo e centrifugare la provetta a 175 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, muovere la provetta per allentare il pellet e lavare nuovamente le cellule aggiungendo 10 mL di AdDMEM/F12 (+++) freddo. Centrifugare la provetta a 175 x g per 5 minuti a 4 °C.
3. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, muovere la provetta per allentare il pellet, risospendere le cellule in 1 mL di AdDMEM/F12(+++) e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro secondo la procedura standard.
4. Da sette a otto cupole si inseriscono in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti quando gli organoidi vengono placcati nella matrice a goccia. Circa 200 μL di matrice produrranno 7-8 cupole. Decidere quanti pozzetti di organoidi sono necessari per futuri scopi sperimentali e calcolare il volume di matrice richiesto. Quindi, calcolare il volume della soluzione contenente cellule necessario per avere una concentrazione finale di 1,0 x 10⁶ cellule/mL di matrice.
5. Dopo aver contato le cellule, centrifugare a 175 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante, agitare la provetta per allentare il pellet e risospendere le cellule in volume della matrice calcolato al punto 3.4.
   NOTA: La matrice rimane in forma liquida solo a 4 °C; Mantenere sempre le provette e le soluzioni di celle a matrice sul ghiaccio.

4. Cupole di matrici di placcatura e applicazione dei mezzi

1. Miscelare la soluzione matrice-cellula con una pipetta P200 per distribuire uniformemente le cellule senza introdurre bolle. Estrarre la piastra di coltura a 6 pozzetti dall'incubatore a 55 °C.
2. Pipettare con cura 200 μl di soluzione matrice-cella e far cadere rapidamente la soluzione in un pozzetto per creare cupole.
3. Ripetere il passaggio 4.2. fino a quando il volume della soluzione matrice-cellula non è esaurito. Lasciare solidificare le cupole a temperatura ambiente per 2 minuti.
4. Capovolgere la piastra a 6 pozzetti e metterla in un'incubatrice a 37 °C per continuare la solidificazione per 20 minuti.
5. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di terreno organoide prostatico di topo a ciascun pozzetto. Aggiungere l'androgeno sintetico R1881 a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 1 nM e l'inibitore della roccia Y-27632 a una concentrazione finale di 10 μM. Mescolare accuratamente e posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C per la coltura.
   NOTA: I terreni di coltura degli organoidi devono essere integrati con l'inibitore della roccia Y-27632 da 10 μM solo per 1 settimana dopo la generazione dell'organoide.

Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo per la generazione di organoidi tumorali prostatici. Dopo aver sezionato il tumore alla prostata, tritare il tessuto in pezzi di 1 mm. Digerire i pezzi tumorali in collagenasi, raccogliere le cellule e digerire in tripsina per ottenere una sospensione di una singola cellula. Dopo aver contato le cellule, risospendere nel volume della matrice richiesto per una concentrazione di 1,0 x 106 cellule/mL di cellule. Piastra le cupole nel piatto usando un metodo a goccia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.