Perfusione epatica murina in vivo: un metodo per infondere il fegato del roditore con una soluzione attraverso la vena porta

Abstract

Fonte: Cabral, F., et al. Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dalla perfusione epatica di topo. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive una procedura per la perfusione epatica di topo attraverso la vena porta utilizzando una soluzione di collagenasi prima di isolare le cellule epatiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione

1. Preparazione di soluzioni e terreni di coltura
   1. Preparare tutti i terreni di coltura e il tampone secondo la tabella dei materiali.
2. Preparazione degli strumenti
   1. Predisporre un bagnomaria (>10 L) a 42 °C, una pompa peristaltica a velocità variabile e pinze per il contenimento dei palloni. Preparare forbici e pinze curve (Figura 1).
   2. ....

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica della suite di perfusione. I palloni sono tenuti in posizione da morsetti (non mostrati); il tubo contenente il fluido viene scambiato dal pallone da 1 litro al pallone da 125 ml durante la procedura è rappresentato dalla linea tratteggiata rossa. Si noti che l'ossigeno non bolle direttamente nelle soluzioni contenute nei matracci. I tappi devono .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 L di fiasco di Erlenmeyer	Fisher Scientifico	S63274
Pallone di Erlenmeyer da 250 ml	Fisher Scientifico	S63271
Tubi in silicone	Cole-Parmer	96400-14	Questo tubo va dai palloni attraverso la pompa fino al connettore a T e quindi alla siringa da 1,0 ml collegata al catetere.
Tubi Tygon	Fisher Scientifico	Codice: R3603	Utilizzato come adattatore tra 96400-14 e pipette e connettore a T. Può essere utilizzato anche per il tubo dell'ossigeno.
Connettori a T	Cole-Parmer	EW-06294-82
Disconnessioni rapide	Fisher Scientifico	6150-0010
Morsetti a pizzico	Fisher Scientifico	Codice 6165-0002
Pompa a velocità variabile Masterflex L/S; modello 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Pompa periplastica a velocità variabile
Testa della pompa; modello 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
Pipette graduate in vetro da 1,0 mL	Fisher Scientifico	13-678
Forbici curve non seghettate	Strumenti per la scienza	Codice 14069-12
Pinza di Dumont	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20
Pinze curve	Strumenti per la scienza	Codice 13009-12
Siringa da 10 ml	Fisher Scientifico	03-377-23	Sarà necessario solo il barilotto della siringa
Cucchiaio sterilizzato	Negozio di articoli per la casa
Batuffolo di cotone	Negozio di articoli per la casa
Filo per cucire in poliestere	Negozio di articoli per la casa
Nastro adesivo	Negozio di articoli per la casa
Puntine da disegno	Negozio di articoli per la casa
Cuscinetto in polistirolo	Rack conico da 50 mL
Biscotto/teglia	Negozio di articoli per la casa
Sottocuscinetti assorbenti	Fisher Scientifico	14-206-64
19 L di bagnomaria	Fisher Scientifico	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Catetere IV schermato calibro 24	Becton Dickinson	381412	Catetere in plastica con ago retrattile
Piastre di cristallizzazione 100x50	VWR	89000-290
Piastre di Petri in polistirene	Sigma Aldrich	P5481-500EA
Provette coniche da 50 mL	Fisher Scientifico	12-565-270
Pipette graduate (5 mL)	Fisher Scientifico	170355
Pipette graduate (25 mL)	Fisher Scientifico	170357
Filtro EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	Codice: 542000	Filtro da 100 μm
Filtro EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	Codice: 542040	Filtro da 40 μm
Reagenti
nome	composto	Grammi (g/L)	Millimolare (mM)
Tampone 1; pH 7,4	NaCl	8.3	142
	Kcl	0,5	6.7
	HEPES	2.4	10
	Bsa	15	0,226
Tampone 2; pH 7,4	NaCl	3.9	66,74
	Kcl	0,5	6,71
	CaCl2	0,7	6.31
	HEPES	24	100
	Bsa	15	0,226
	Rosso fenolo	0,01	0,03
PBS; pH 7,4	NaCl	8	137
Kcl	0,2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0,2	1.4
ALTRI REAGENTI
nome	società	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi di tipo IV	Sigma Aldrich	Codice: C5138
Isoflurano	Abcam	ab144581