Saggio di spin down dell'agarosio: una tecnica per incorporare organoidi per l'analisi istologica

1. Elaborazione di organoidi per istologia: il metodo di spin down dell'agarosio

NOTA: Questo protocollo è adattato da una precedente pubblicazione di Vlachogiannis et al. Abbiamo aggiunto una fase che coinvolge l'inclusione dell'agarosio per incorporare con successo tutte le popolazioni di organoidi.

1. Rimuovere il supporto esistente dal pozzo. Fare attenzione a non aspirare le cupole della membrana del seminterrato.
2. Aggiungere un volume uguale (uguale al volume del terreno rimosso dalla fase 1) di soluzione di recupero cellulare e incubare per 60 minuti a 4 °C.
3. Smuovere la cupola della membrana basale utilizzando una pipetta e schiacciare la cupola della membrana basale utilizzando una punta per pipetta. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in una provetta da 1,5 mL.
4. Centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante (soluzione per il recupero cellulare). Conservare tutti i surnatanti in provette separate fino alla fine, quando la presenza di organoidi è confermata nella fase finale di pellettatura.
6. Aggiungere il volume desiderato (Tabella 1) di PBS freddo e pipettare delicatamente su e giù per disturbare meccanicamente il pellet.
7. Centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
8. Rimuovere il surnatante (PBS).
9. Fissare il pellet in un volume corrispondente (ad es. 500 μl per un pellet dalla condizione di coltura su piastra a 24 pozzetti, Tabella 1) di PFA al 4% per 60 minuti a temperatura ambiente.
10. Dopo il fissaggio, centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
11. Rimuovere il surnatante (PFA).
12. Lavare con un volume corrispondente (ad es. 500 μl per un pellet dalla condizione di coltura su piastra a 24 pozzetti, Tabella 1) di PBS e centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 minuti.
13. Preparare l'agarosio caldo (2% di agarosio in PBS).
    nota: Qui, i pellet cellulari per sezioni congelate possono essere risospesi direttamente in 200 μL di composto OCT.
14. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di agarosio (2% in PBS).
    1. Immediatamente dopo l'aggiunta dell'agarosio, staccare delicatamente il pellet cellulare dalla parete della provetta da 1,5 mL utilizzando l'ago da 25 G collegato alla siringa da 1 mL. Come mostrato nella Figura 1, se il pellet cellulare non viene fisicamente staccato dalla parete della provetta da 1,5 mL, c'è il rischio di perdere tutto o parte del pellet cellulare durante il processo di inclusione dell'agarosio.
15. Attendere che l'agarosio al 2% nella PBS sia completamente solidificato.
16. Staccare il blocco di agarosio solidificato dalla provetta da 1,5 mL utilizzando un ago da 25 G collegato alla siringa da 1 mL.
17. Trasferire il blocco di agarosio staccato contenente il pellet cellulare in una nuova provetta da 1,5 mL.
18. Riempire la provetta con il 70% di EtOH e procedere ulteriormente utilizzando il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'inclusione di paraffina.

Tabella 1: Densità di semina, volume della membrana basale e volume medio necessari per una cupola

Figura 1: Un passaggio chiave per il successo dell'inclusione dell'agarosio. Un processo per staccare il pellet cellulare dalla parete della provetta da 1,5 mL.