Saggio di spin down dell'agarosio: una tecnica per incorporare organoidi per l'analisi istologica

Abstract

Fonte: Lee, S. et al. Istituzione e analisi di organoidi tridimensionali (3D) derivati da campioni di metastasi ossee di cancro alla prostata di pazienti e loro xenotrapianti. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, eseguiamo un test spin-down per incorporare organoidi 3D per il cancro alla prostata nell'agarosio. Questi organoidi incorporati possono essere utilizzati per ulteriori analisi istopatologiche per studiare la crescita e lo sviluppo del cancro.

Protocollo

1. Elaborazione di organoidi per istologia: il metodo di spin down dell'agarosio

NOTA: Questo protocollo è adattato da una precedente pubblicazione di Vlachogiannis et al. Abbiamo aggiunto una fase che coinvolge l'inclusione dell'agarosio per incorporare con successo tutte le popolazioni di organoidi.

1. Rimuovere il supporto esistente dal pozzo. Fare attenzione a non aspirare le cupole della membrana del seminterrato.
2. Aggiungere un volume uguale (uguale al volume del terreno rimosso dalla fase 1) di soluzione di recupero cellulare e incubare per 60 minuti a 4 °C.
3. Smuovere la cupola della membrana basale utilizzando una pipetta e schiacciare la cupola della membrana basale utilizzando una punta per pipetta. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in una provetta da 1,5 mL.
4. Centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante (soluzione per il recupero cellulare). Conservare tutti i surnatanti in provette separate fino alla fine, quando la presenza di organoidi è confermata nella fase finale di pellettatura.
6. Aggiungere il volume desiderato (Tabella 1) di PBS freddo e pipettare delicatamente su e giù per disturbare meccanicamente il pellet.
7. Centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
8. Rimuovere il surnatante (PBS).
9. Fissare il pellet in un volume corrispondente (ad es. 500 μl per un pellet dalla condizione di coltura su piastra a 24 pozzetti, Tabella 1) di PFA al 4% per 60 minuti a temperatura ambiente.
10. Dopo il fissaggio, centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 min.
11. Rimuovere il surnatante (PFA).
12. Lavare con un volume corrispondente (ad es. 500 μl per un pellet dalla condizione di coltura su piastra a 24 pozzetti, Tabella 1) di PBS e centrifugare a 300 x g e 4 °C per 5 minuti.
13. Preparare l'agarosio caldo (2% di agarosio in PBS).
    nota: Qui, i pellet cellulari per sezioni congelate possono essere risospesi direttamente in 200 μL di composto OCT.
14. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di agarosio (2% in PBS).
    1. Immediatamente dopo l'aggiunta dell'agarosio, staccare delicatamente il pellet cellulare dalla parete della provetta da 1,5 mL utilizzando l'ago da 25 G collegato alla siringa da 1 mL. Come mostrato nella Figura 1, se il pellet cellulare non viene fisicamente staccato dalla parete della provetta da 1,5 mL, c'è il rischio di perdere tutto o parte del pellet cellulare durante il processo di inclusione dell'agarosio.
15. Attendere che l'agarosio al 2% nella PBS sia completamente solidificato.
16. Staccare il blocco di agarosio solidificato dalla provetta da 1,5 mL utilizzando un ago da 25 G collegato alla siringa da 1 mL.
17. Trasferire il blocco di agarosio staccato contenente il pellet cellulare in una nuova provetta da 1,5 mL.
18. Riempire la provetta con il 70% di EtOH e procedere ulteriormente utilizzando il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'inclusione di paraffina.

Tabella 1: Densità di semina, volume della membrana basale e volume medio necessari per una cupola

Piatto di coltura	Densità di semina (cellule)	Volume della membrana basale (μL)	Terreno (μL)
48 pozzetti	25.000-50.000	20	250
24 pozzetti	50.000-250.000	40	500
6 pozzetti	50.000-250.000	40	2.000

Risultati

Figura 1: Un passaggio chiave per il successo dell'inclusione dell'agarosio. Un processo per staccare il pellet cellulare dalla parete della provetta da 1,5 mL.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 ml di Pipettman	Gilson	F123602
Siringa da 1 ml	Siringa BD	329654
Provetta da 1,5 mL	Prodotti Spectrum Lab	941-11326-ATP083
Ago da 25 G	Ago BD PrecisionGlide	305122
4% Paraformaldeide (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Etanolo (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
agarosio	Lonza	50000
Piastra per colture cellulari - 24 pozzetti	Costar	Telefono 3524
Piastra per colture cellulari - 48 pozzetti	Costar	Codice: 3548
Piastra per colture cellulari - 6 pozzetti	Costar	3516
Soluzione di dissociazione cellulare, Accumax	Tecnologie cellulari innovative, Inc.	AM105
Soluzione per il recupero delle cellule	Corning	354253
Raschietto cellulare	Sarstedt	83,18
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
Puntali per pipette da 1 mL (puntali blu)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Centrifuga da tavolo piccola	ThermoFisher Scientifico	75002426
Composto OCT	Tessuto-Tek	4583
Bagno d'acqua	Fisher Sc	Codice: 2320