1. Placcatura di cellule epiteliali prostatiche selezionate in coltura primaria di organoidi di topo — Tempistica: 2-3 ore (esclusa la preparazione della piastra rivestita in poli-HEMA)
NOTA: Le piastre sono rivestite con Poly-HEMA per prevenire la formazione di colonie 2D sulla superficie del pozzetto sotto il gel della matrice. Preparare le piastre rivestite in Poly-HEMA 1 giorno prima di placcare le cellule epiteliali della prostata basali o luminali selezionate in coltura di organoidi di topo. Scongelare 1 mL di aliquote di gel di matrice a ridotto fattore di crescita, di seguito denominato gel di matrice, su ghiaccio 2 ore prima del passaggio 1.1. L'Y-27632 (inibitore ROCK) deve essere aggiunto ai terreni organoidi di topo immediatamente prima della fase 1.1. Eseguire i passaggi 1.1-1.8 sul ghiaccio.
- Pellettare le cellule in provette a fondo tondo da 5 mL mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
- Lavare il pellet cellulare in 500 μl di terreno organoidrico di topo (Tabella 1).
- Pellettare le celle per centrifugazione a 800 x g per 5 min a 4 °C e aspirare il surnatante.
- Risospensione in terreni organoidi di topo a una densità cellulare di 1.000 cellule/μL.
- Per preparare le master mix, mescolare le cellule epiteliali sospese in terreni organoidi di topo con il gel della matrice per generare una miscela finale che contiene il 25% di cellule/terreni e il 75% di gel della matrice. Le celle basali sono tipicamente piastrate a una concentrazione di 100-2.000 cellule/80 μL, mentre le celle luminali sono tipicamente piastrate a una concentrazione di 2.000-10.000 cellule/80 μL. La densità delle celle placcate varia a seconda del giorno di raccolta del materiale previsto e dell'applicazione a valle desiderata.
NOTA: Raffreddare le provette di dimensioni adeguate per il volume previsto della miscela master 5 minuti prima della preparazione della miscela master. Per garantire che il gel della matrice non si indurisca durante la manipolazione, è fondamentale raffreddare il puntale della pipetta pipettando il gel della matrice 3-4 volte prima di trasferirlo in una nuova provetta.
- Aggiungere 80 μl della miscela di gel/cellule della matrice per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Si consiglia di pipettare una goccia sulla metà inferiore della parete del pozzetto, evitando il contatto diretto con il rivestimento Poly-HEMA. Dopo aver aggiunto il gel della matrice, agitare la piastra per consentire alla miscela di gel della matrice/cellula di formare un anello attorno al bordo del pozzetto.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C con il lato destro rivolto verso l'alto per 10 minuti per consentire al gel della matrice di indurirsi parzialmente.
NOTA: Iniziare a riscaldare i terreni organoidi di topo a 37 °C subito dopo aver posizionato la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore.
- Dopo l'incubazione per 10 minuti, capovolgere la piastra a 24 pozzetti e incubare per altri 50 minuti per consentire al gel della matrice di indurirsi completamente.
- Aggiungere 350 μl di terreno organoide di topo preriscaldato goccia a goccia al centro di ciascun pozzetto.
NOTA: Per mantenere l'integrità del gel della matrice, è fondamentale evitare l'anello di gel della matrice durante l'aggiunta del terreno.
- Dopo aver aggiunto il terreno, rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 °C al 5% di CO2
.
2. Rifornimento di terreni organoidi di topo - TEMPISTICA: 10-15 minuti per piastra da 24 pozzetti
NOTA: I supporti esistenti dovrebbero essere sostituiti con nuovi supporti ogni 48 ore. Prima di ogni cambio di terreno, preriscaldare i terreni organoidi di topo. Non è necessario aggiungere l'inibitore ROCK al terreno utilizzato per il rifornimento.
- Inclinare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45° e rimuovere delicatamente il terreno esistente dal centro di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta P1000 evitando l'anello di gel della matrice.
- Aggiungere 350 μl di terreno organoidrico di topo preriscaldato come al punto 1.9. Si raccomanda di aggiungere un volume maggiore di terreno (fino a 1 mL) agli organoidi coltivati per più di 5 giorni per prevenire il rapido esaurimento dei nutrienti chiave e dei fattori di crescita.
Tabella 1: Istruzioni per la preparazione di terreni organoidi di topo
|
componente
| concentrazione
|
| B-27 | 1x (diluire da 50x concentrato) |
| GlutaMAX | 1x (diluire da 100x concentrato) |
| N-acetil-L-cisteina | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| EGF umano ricombinante, senza animali | 50 ng/mL |
| Noggin umana ricombinante | 100 ng/mL |
| Mezzi condizionati con R-spondina 1 | 10% di terreni condizionati |
| A83-01 | 200 nM |
| DHT | 1 nM |
| Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avanzato | Supporti di base |
| R-spondina 1-terreno condizionato viene generato come descritto in Drost et al. Dopo l'aggiunta di tutti i componenti, filtrare sterilizzare i terreni organoidi di topo utilizzando un filtro da 0,22 μm. L'inibitore ROCK viene aggiunto solo durante l'instaurazione della coltura e il passaggio degli organoidi. |
