Estrazione del lisato proteico: una tecnica per lisare gli organoidi per raccogliere le proteine cellulari

Abstract

Fonte: Crowell, P. D. et al. Valutazione della capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata di topo utilizzando la coltura di organoidi. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo l'estrazione di lisati proteici da organoidi prostatici coltivati in un anello di matrice di membrana basale. L'analisi delle frazioni proteiche estratte può aiutare a studiare l'espressione del marcatore di lineage negli organoidi.

Protocollo

1. Estrazione del lisato proteico da organoidi prostatici per l'analisi Western Blot — Tempistica: 2.5-4 H

NOTA: Prima di raccogliere gli organoidi per l'estrazione del lisato proteico, preparare e preriscaldare i terreni contenenti dispasi (Tabella 1).

1. Rimuovere il terreno da ciascun pozzetto inclinando la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45° e rimuovendo delicatamente il terreno esistente dal centro di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta P1000 evitando l'anello di gel della matrice.
2. Per raccogliere gli organoidi, far esplodere ripetutamente il gel della matrice pipettando 1 mL di terreno contenente dispasi direttamente sull'anello del gel della matrice fino a rimuovere l'intero anello e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: È fondamentale evitare il contatto diretto con i pozzetti rivestiti in poli-HEMA. Il contatto diretto può causare la contaminazione del materiale raccolto con Poly-HEMA, che potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza cellulare.
3. Posizionare la/e provetta/e da microcentrifuga da 1,5 mL in un incubatore a 37 °C 5% CO₂ per 30 minuti a 1 ora per consentire la completa digestione del gel della matrice mediante dispasi.
4. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.
5. Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al pellet dell'organoide e risospendere muovendo delicatamente.
   NOTA: La mancata risospensione sufficiente del pellet dell'organoide può causare la contaminazione del materiale dell'organoide con la dispasi residua o il gel della matrice.
6. Pellet gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 5 min a RT e rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.
7. Congelare rapidamente i pellet di organoidi inserendo ogni provetta in una soluzione contenente ghiaccio secco e metanolo. Conservare le provette fino al futuro utilizzo a -80 °C. In alternativa, estrarre il lisato proteico immediatamente dopo il passaggio 1.6.
8. Risospendere i pellet di organoidi in 100 μL di tampone di lisi proteica (Tabella 1) per 10 μL di volume di cellule impaccate. Scorri per riattivare.
   NOTA: Se si riprende dopo il congelamento rapido, assicurarsi che il tampone di lisi proteica sia scongelato prima di rimuovere i campioni da -80 °C, poiché il tampone di lisi deve essere aggiunto immediatamente ai campioni per prevenire l'attività della fosfatasi e della proteasi.
9. Incubare i campioni nel tampone di lisi proteica su ghiaccio per almeno 45 min.
   NOTA: Si consiglia di sonicare prima dell'incubazione su ghiaccio per aumentare l'efficienza del recupero delle proteine nucleari; Tuttavia, la sonicazione non è richiesta. Se la sonicazione non viene eseguita, procedere al passaggio 1.10.
   1. Per sonicare, immergere le provette nel ghiaccio umido e applicare delicatamente la punta del dismembratore sonico alla provetta della microcentrifuga. Sonicare per 40 s a 20 kHz.
10. Procedere al Western blot seguendo i protocolli stabiliti.

Tabella 1: Istruzioni per la preparazione delle soluzioni chiave

Ricette
Supporti contenenti dispasi	1 mg/mL di dispasi + 10 μM di inibitore di ROCK in DMEM F12 avanzato. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm.
Mezzi di dissociazione	10% FBS + 1x Penicillina-Streptomicina in RPMI 1640. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm.
Tampone per lisi proteica	tampone RIPA + inibitori della fosfatasi + inibitori della proteasi
Soluzione bloccante	10% FBS in PBS con 0,2% Triton X-100

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
A83-01	Tocris	Codice: 2939
DMEM/F-12 avanzato	Thermo Fisher Scientifico	12634010
Integratore di B-27 (50x), senza siero	Thermo Fisher Scientifico	17504044
Dispase II, Polvere	Thermo Fisher Scientifico	Codice 17-105-041
Siero fetale bovino (FBS)	sigma	F8667
GlutaMAX Thermo	Fisher Scientifico	35050061
Fermare l'inibitore della fosfatasi	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 78428
Matrice a membrana Matrigel GFR	Corning CB-	40230C
N-acetil-L-cisteina	sigma	Codice: A9165
Normocin	Thermo Fisher Scientifico	formica-nr-1
Penicillina-streptomicina (10.000 U/ ml)	Thermo Fisher Scientifico	15-140-122
Poli(2-idrossietilmetacrilato) (Poli-HEMA)	sigma	P3932-25G
Test di radioimmunoprecipitazione (RIPA)	Thermo Fisher Scientifico	PI89901
EGF umano ricombinante, senza animali	PeproTech	AF-100-15
Noggin umana ricombinante	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Medio, HEPES (cs di 10)	Thermo Fisher Scientifico	22400105
Sonic Dismembrator	Thermo Fisher Scientifico	FB120
Triton X-100	sigma	X100-5ML
Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK)	Selleck Chemical	S1049-50MG