Imaging in immunofluorescenza a montaggio intero: una tecnica di fissazione e colorazione per valutare organoidi intatti

1. Fissaggio e colorazione di organoidi prostatici per analisi immunoistochimiche mediante microscopia confocale a montaggio intero

1. Raccolta di organoidi prostatici da piastre a 24 pozzetti — TEMPISTICHE: 45-60 min
   NOTA: Quando si raccolgono gli organoidi prostatici da processare per la microscopia confocale, è fondamentale maneggiarli con cura per mantenerne la struttura. Il protocollo di raccolta riportato di seguito è progettato per ridurre l'interruzione della struttura dell'organoide durante l'isolamento.
   1. Rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra contenente organoidi inclinando la piastra di un angolo di 45°.
   2. Digerire il gel della matrice incubandolo con 500 μL di terreno contenente dispasi (Tabella 1) per 30 minuti in un incubatore a 37 °C 5% CO₂
   .
   3. Raccogliere la sospensione di organoidi digeriti in una provetta da microcentrifuga e pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante.
2. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero di organoidi prostatici - TEMPISTICA: 3-4 giorni (1-5 ore/giorno)
   1. Aggiungere 500 μl di paraformaldeide al 4% in PBS e incubare per 2 ore a RT agitando delicatamente.
   2. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 minuti agitando delicatamente.
   3. Lavare il pellet come al punto 1.2.2 per altre due volte.
   4. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 μg/mL di DAPI nella soluzione bloccante (Tabella 1). Incubare per 2 ore a RT o in alternativa per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
   5. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere l'anticorpo primario (coniglio anti-p63, topo anti-citocheratina 8) in soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
   6. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 minuti agitando delicatamente.
   7. Lavare il pellet come al punto 1.2.6 per altre due volte.
   8. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere l'anticorpo secondario (capra anti-coniglio IgG-Alexa Fluor 594, capra anti-topo IgG-Alexa Fluor 488) in soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
   9. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di PBS per 15 minuti agitando delicatamente.
   10. Lavare il pellet come al punto 1.2.9 per altre due volte.

2. Pulizia dei tessuti e montaggio degli organoidi prostatici colorati per microscopia confocale a montaggio intero - TEMPISTICA: 7 H

1. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere 1 mL di saccarosio al 30% in PBS con Triton X-100 all'1% e incubare per 2 ore a RT agitando delicatamente.
3. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
4. Aggiungere 1 mL di saccarosio al 45% in PBS con Triton X-100 all'1% e incubare per 2 ore a RT agitando delicatamente.
5. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 1 mL di saccarosio al 60% in PBS con Triton X-100 all'1% e incubare per 2 ore a RT agitando delicatamente.
7. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il 95% del surnatante.
   NOTA: Il pellet si allenta man mano che la concentrazione di saccarosio aumenta. Si raccomanda di osservare gli organoidi colorati con DAPI sotto la luce UV per confermare che non siano andati persi durante la rimozione del surnatante.
8. Trasferire una goccia da 10-20 μL della sospensione rimanente in un vetrino coprioggetti a camera e procedere alla microscopia confocale.
   NOTA: I frammenti del vetrino coprioggetti possono essere posizionati su entrambi i lati della gocciolina per essere utilizzati come distanziatori (Figura 1C). Questi impediscono agli organoidi di collassare quando un vetrino coprioggetti viene posizionato sopra la gocciolina.

Tabella 1: Istruzioni per la preparazione delle soluzioni chiave

Figura 1: Analisi dell'espressione di marcatori di lignaggio in organoidi prostatici mediante Western blot e microscopia confocale a montaggio intero.(A) Immagini rappresentative a contrasto di fase di organoidi di derivazione basale (in alto) e di derivazione luminale (in basso) dopo 7 giorni di coltura. Barra della scala = 100 μm. (B) Analisi Western blot di organoidi di derivazione basale (Bas) e luminale (Lum) dopo 5 giorni di coltura. Colorazione per il marcatore basale, citocheratina 5 (K5), e il marcatore luminale, citocheratina 8 (K8), e un controllo di carico, istone H3 (HH3). (C) Schema illustrativo del vetrino coprioggetto camerato con distanziatori. (D) Immagini rappresentative di contrasto interferenziale differenziale (DIC) e immunofluorescenti di organoidi di derivazione basale (in alto) e luminali (in basso) dopo 7 giorni di coltura. Colorazione per p63 (rosso), K8 (verde) e DAPI (blu) singolarmente e uniti. Barre di scala = 100 μm.