Isolamento funzionalizzato delle cellule bersaglio basate su fili: una tecnica ex vivo per isolare le cellule tumorali dal sangue periferico spiked

NOTA: Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule HT-29 (linea cellulare di cancro del colon umano) da PBS o da miscele artificiali di cellule HT-29 e sangue periferico. Lo stesso esperimento è stato eseguito con due linee cellulari aggiuntive (LNCaP e VCaP) e può teoricamente essere eseguito con tutte le cellule che esprimono EpCAM.

1. Preparazione delle cellule bersaglio

1. Coltura cellulare e marcatura di cellule
   nota: In questo protocollo, le cellule vengono coltivate in fiasche di coltura da 75 cm². Si prega di regolare le quantità di reagenti di conseguenza se si utilizzano altri dispositivi di coltura cellulare (ad es. piastre di coltura da 25 cm², piastre a 6 pozzetti, ecc.). Tutti i liquidi utilizzati vengono preriscaldati a 37 °C in un bagno d'acqua. Se non diversamente indicato, tutti i passaggi del protocollo vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT).
   1. Coltura di cellule HT-29 nel terreno modificato 5a di McCoy con 2 mM di L-glutammina, 20 mM di Hepes, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%.
   2. Quando le cellule sono confluenti al 90%, rimuovere il terreno e sciacquare le cellule con 10 ml di 1x PBS.
   3. Per prelevare le cellule, aggiungere 2 mL della soluzione di distacco cellulare (Tabella dei materiali e dei reagenti) alle cellule e incubare le cellule per circa 5 minuti a 37 °C.
      nota: La soluzione di distacco contiene enzimi proteolitici e collagenolitici in 1x PBS, 0,5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 3 mg/L di rosso fenolo. Ridurre al minimo il tempo di preriscaldamento della soluzione di distacco cellulare, che sarà inattivo dopo 1 ora a 37 °C. Coprire l'intero strato cellulare per ottenere un distacco cellulare ottimale.
   4. Controllare il distacco delle cellule utilizzando un microscopio invertito.
   5. Trasferire tutte le cellule staccate in una provetta da 50 mL preriempita con 10 mL di terreno di coltura cellulare (come utilizzato nella fase 1.1.1) e risospendere le cellule mediante pipettaggio.
   6. Posizionare la sospensione della cella rimanente su un miscelatore a rulli orizzontali a RT e procedere alla fase di etichettatura.
2. Marcatura di cellule bersaglio vive
   1. Diluire 1 μL di 5 mM di CFSE (fornito in dimetilsolfossido, DMSO) in 1 mL di 1x PBS preriscaldato a 37 °C per ottenere la soluzione di marcatura CFSE pronta all'uso da 5 μM.
      nota: Per risultati di colorazione ottimali, utilizzare soluzioni appena preparate.
   2. Preparare una soluzione di colorazione del DNA pronta all'uso (Tabella dei materiali e dei reagenti) in 1x PBS e conservarla a 2-6 °C al riparo dalla luce.
      nota: Per risultati di colorazione ottimali, utilizzare soluzioni appena preparate.
   3. Prelevare le celle dal miscelatore a rulli orizzontali (passaggio 1.1.6.) e pellettare le celle a 300 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di 1x PBS.
   4. Sciacquare nuovamente le celle con 1x PBS e risospendere il pellet di cella in una soluzione di marcatura CFSE pronta all'uso da 500 μl.
   5. Incubare le cellule a 37 °C per 15 minuti e raccogliere le cellule dopo la centrifugazione a 300 x g per 3 minuti.
   6. Risospendere le cellule marcate in 1 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato e lasciare che le cellule si rigenerino a 37 °C per 30 minuti.
   7. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 3 minuti e risospendere i pellet cellulari in 1 mL di soluzione di colorazione del DNA pronta all'uso a 37 °C per 10 minuti.
   8. Pellettare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 4 mL di 1x PBS. Valutare la densità cellulare utilizzando un emocitometro e verificare la marcatura della fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Figura 1A e 1E).
   9. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti e risospendere il pellet di cella in base alle densità cellulari necessarie per il rispettivo esperimento, come indicato nella sezione successiva, e porre su ghiaccio.

2. Caricare il Filo

NOTA: Le cellule possono essere isolate da picchi di cellule bersaglio/sangue periferico su scala di millilitri o fornendo un basso numero di cellule su scala di microlitri. Mentre il primo approccio consente di imitare le condizioni delle cellule rare nel sangue periferico, il secondo potrebbe essere il modo preferito per attaccare alcune cellule ai fini dell'ottimizzazione/test del protocollo.

1. Caricamento del filo utilizzando un grande volume di sospensioni di celle
   1. Preparare una soluzione bloccante BSA al 2% sciogliendo 0,8 g di BSA in 40 mL di 1x PBS (uso in coltura cellulare). Sciogliere BSA mediante vortice iniziale e successiva incubazione a RT su un miscelatore a rulli orizzontali per 10-20 minuti.
   2. Sciacquare le provette vuote di EDTA/provette di sodio eparina con 2 mL di BSA al 2% per rimuovere i residui di anticoagulante ed eliminare la soluzione. Bloccare la superficie della provetta mediante incubazione a RT con 5 mL di BSA al 2% su un miscelatore a rulli orizzontali a 15 giri/min per 30 minuti e scartare la soluzione.
   3. Diluire le cellule marcate (sezione 1.2) a una densità di 100.000 cellule/mL e utilizzare 5 mL per caricare il filo.
   4. Aggiungere 5 mL della sospensione cellulare marcata (500.000 cellule in totale) alla provetta. Evitare la formazione di bolle quando si aggiunge la sospensione cellulare.
   5. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti e il cappuccio di gomma che tiene il filo e sciacquarlo con 1x PBS (Figura 2).
   6. Penetrare il tappo di gomma del tubo EDTA (passaggio 2.1.4.) con l'aiuto di un ago per siringa (20 G) e inserire il filo in modo che la parte funzionale sia completamente immersa nella sospensione cellulare quando il tappo è di nuovo sul tubo e il tubo posizionato sul miscelatore a rulli inclinati.
      nota: La parte funzionale a tripla elica del filo deve essere coperta con una sospensione di celle durante la carica.
   7. Ruotare i tubi su un miscelatore a rulli inclinati a 5 giri/min per 30 minuti per consentire alle celle di attaccarsi al filo.
   8. Sciacquare il filo con 5 mL di 1x PBS e conservarlo al buio a 2-6 °C in una provetta da 15 mL contenente 1x PBS fino all'esame visivo.
      nota: La parte funzionale del filo deve essere sempre immersa nel PBS per evitare di danneggiare le celle.
2. Isolamento di cellule bersaglio da miscele artificiali con sangue periferico (metodo di ricarica alternativo a: 2.1. Caricare il filo utilizzando un grande volume di sospensioni cellulari)
   1. Diluire le cellule marcate (paragrafo 1.2) per ottenere sospensioni cellulari con un'elevata densità cellulare (> 1.000.000 di cellule/mL), mantenendo così basso il volume della sospensione cellulare aggiunta al sangue periferico.
   2. Aggiungere da 500 a 500.000 cellule a 5 ml di sangue periferico e mescolarle capovolgendo la provetta.
   3. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti, rimuovere il tappo di gomma che tiene il filo e risciacquarlo con 1x PBS.
   4. Penetrare un nuovo tappo del tubo con la parte non funzionante del dispositivo utilizzando un ago per siringa (20 G) in modo tale che la parte funzionale sia completamente immersa nel sangue a spillo quando il tappo è di nuovo sul tubo e il tubo è posizionato sul miscelatore a rulli inclinati.
      nota: La parte funzionale a tripla elica del filo deve essere coperta con una sospensione di celle durante la carica.
   5. Incubare la provetta sul miscelatore a rulli inclinati a 5 giri/min per 30 minuti a RT.
   6. Sciacquare il filo tre volte in 1x PBS e conservarlo al buio in una provetta da 15 ml contenente 1x PBS fino all'esame visivo.
      nota: La parte funzionale del filo deve essere sempre sommersa per evitare di danneggiare le celle.
3. Ricarica del cavo da sospensioni di celle a basso volume (metodo di ricarica alternativo a: 2.1. Caricare il filo utilizzando un grande volume di sospensioni cellulari)
   1. Risospendere le cellule marcate a 1.000.000 di cellule/mL in 1x PBS.
   2. Fissare orizzontalmente una pipetta Pasteur monouso in vetro da 150 mm su una griglia.
   3. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti, ma tenere il cappuccio di gomma giallo che tiene il filo.
   4. Posizionare il filo nella pipetta in modo che la parte funzionalizzata si trovi nella punta della pipetta Pasteur senza toccare il vetro.
      nota: La punta del filo non deve sporgere dal puntale della pipetta Pasteur. Evitare di ostruire l'estremità posteriore del puntale della pipetta Pasteur con il tappo di gomma che tiene il filo. Se fissate saldamente, le sospensioni cellulari non possono essere caricate dall'altro lato nel puntale della pipetta.
   5. Caricare 15 μl della sospensione cellulare nella punta della pipetta Pasteur coprendo la parte funzionalizzata del filo.
   6. Incubare il filo per 10 minuti. Girare manualmente un quarto di giro il filo assemblato/punta della pipetta Pasteur ogni minuto.
   7. Rimuovere il filo dal puntale della pipetta Pasteur, sciacquarlo in 5 mL di 1x PBS e conservarlo al buio a 2-6 °C in una provetta da 15 mL contenente 1x PBS fino all'esame visivo.
      nota: La parte funzionale deve essere sempre immersa in 1x PBS per evitare di danneggiare le cellule.

3. Contare le Celle sul Filo

NOTA: Mantieni sempre la parte funzionale del filo immersa in 1x PBS per evitare di danneggiare le celle.

1. Utilizzare una penna grassa per disegnare un'area rettangolare su un vetrino e aggiungere 500 μl di 1x PBS.
2. Piegare la parte non funzionale del filo e posizionarla sul vetrino in modo tale che la parte funzionale sia immersa in 1x PBS.
   nota: Montare l'area del rettangolo e il volume di 1x PBS per coprire completamente la parte funzionale del filo. Utilizzare un nastro biadesivo per montare la parte non funzionale del filo sulla guida.
3. Ispezionare visivamente entrambi i lati del filo per enumerare le celle catturate (Figura 1B e 1F).
   nota: La presenza di cellule viene determinata utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI e FITC. Entrambi i lati del filo possono essere ispezionati e il numero di celle può essere valutato (per un numero elevato di celle) o contato (possibile solo se un numero basso di celle è attaccato al filo). Questo passaggio può essere ignorato se l'enumerazione delle celle non è necessaria.
4. Dopo la scansione, reinserire il filo nella provetta da 15 ml contenente il PBS 1x, conservare il filo al buio.
   nota: La maggior parte della parte non funzionale del filo può essere tagliata (compresa la curva) e rimossa facilitando lo stoccaggio.

4. Distacco e recupero delle cellule bersaglio

NOTA: Il distacco delle celle deve essere effettuato entro 4 ore dall'isolamento.

1. Sciogliere 4 mg del componente tampone di rilascio (Tabella dei materiali e dei reagenti) per mL di 1x PBS e filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,2 μm per ottenere il tampone pronto all'uso.
   nota: Il polimero del filo è composto da un idrogel che viene funzionalizzato con anticorpi anti-EpCAM che consentono il legame con le cellule bersaglio che presentano EpCAM. Il tampone di rilascio contiene un enzima proteolitico carbonio-ossigeno in grado di scindere l'idrogel. La scissione proteolitica provoca la degradazione del polimero e quindi il distacco delle cellule catturate.
2. Preriscaldare il tampone di rilascio a 37 °C per 5 minuti.
3. Aggiungere 1,6 mL di tampone di rilascio per riempire una provetta di reazione da 1,5 mL.
   nota: Le provette progettate per volumi di reazione di 1,5 mL consentono l'applicazione di 1,6 mL, necessaria per immergere la parte funzionale del filo.
4. Incubare la parte funzionale del filo nel tampone di rilascio a 37 °C (bagno d'acqua) per 20 minuti. Utilizzare il tappo di gomma fornito con il filo invece del tappo della provetta per fissare il filo nella provetta da 1,5 mL per evitare contaminazioni durante l'incubazione nel bagno d'acqua.
5. Trasferire il gruppo filo/tubo in uno shaker a RT e 500 giri/min per 15 min.
   nota: L'agitatore ha un'orbita di 1,5 mm.
6. Mettere il gruppo filo/tubo in una centrifuga e centrifugarlo a 300 x g per 10 minuti.
7. Togliere il filo dalla provetta, chiudere il tappo e centrifugare nuovamente la provetta a 300 x g per 10 min.
   nota: Il filo può essere conservato in 1x PBS a 2-6 °C al buio per il conteggio delle cellule per valutare l'efficienza di distacco/verificare la presenza di celle rimaste sul filo.
8. Per ridurre il volume della sospensione cellulare, rimuovere tutti tranne 100 μL (micromanipolazione) o in alternativa 300 μL (citocentrifugazione e successiva microdissezione laser) del surnatante e procedere immediatamente al campionamento su singola cellula.

Figura 1: Visualizzazione delle celle etichettate.(A,E) Cellule prima della carica: le cellule vengono marcate con CFSE e controcolorate con un colorante intercalante di DNA che mostra un intervallo di intensità del segnale CFSE (verde). (B,F) Cellule marcate catturate sul filo. (C,G) Filo dopo la procedura di distacco delle cellule. (D,H) Cellule staccate dal filo e recuperate mediante citocentrifugazione su un vetrino. CFSE: canale FITC (verde). Colorazione del DNA: canale DAPI (blu).

Figura 2: Figura 2: Vano portacavi e portaoggetti.(A) Compartimenti del filo. (B) Dettaglio della parte funzionalizzata.