Campionamento di singole cellule mediante micromanipolazione: una tecnica per isolare singole cellule dalla sospensione di cellule tumorali

Abstract

Fonte: Chen S. et al. Pre-arricchimento delle cellule bersaglio e amplificazione dell'intero genoma per la caratterizzazione a valle di singole cellule. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica per isolare singole cellule da un pool di cellule bersaglio per eseguire analisi a valle. In questo metodo, un micromanipolatore montato su un microscopio viene utilizzato per l'isolamento ad alta precisione di una singola cellula bersaglio.

Protocollo

1. Campionamento a cella singola

1. Micromanipolazione
   NOTA: Per consentire applicazioni a valle come l'analisi dell'intero genoma (WGA), singole cellule isolate verranno aggiunte a 2 μL di master mix di lisi cellulare. Preparare una master mix in base al numero di celle da lavorare. Calcolare i volumi extra per la perdita dovuta al pipettaggio e posizionare la miscela master di lisi cellulare sul ghiaccio.
   1. Preparare la miscela master di lisi cellulare (componenti del kit WGA, tabella dei materiali e dei reagenti). In breve, miscelare 2,0 μL di tampone di reazione, 1,3 μL di ottilfenossipolietossietanolo (soluzione al 10%), 1,3 μL di glicole fenilpolietilenico 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) (soluzione al 10%), 2,6 μL di una soluzione di proteinasi K e 12,8 μL di RNasi/acqua priva di DNasi per ottenere una miscela master per 10 campioni (volume totale 20 μL).
      nota: Per più campioni, aumentare i volumi di conseguenza.      
   2. Usa una penna per grasso per disegnare un'area che tiene in posizione la sospensione cellulare. Regolare l'area e il volume se la densità delle celle è troppo alta (ad esempio, contrassegnare un'area più grande sul vetrino, caricare 1x PBS e un'aliquota della sospensione delle celle).
   3. Pipettare l'intera sospensione di cellule target sul vetrino.
   4. Trasferire il vetrino su un microscopio dotato di micromanipolatore. Lasciare riposare le celle per 5 minuti.
   5. Preparare provette PCR da 0,2 mL caricate con 2,0 μL di master mix di lisi cellulare (preparata al punto 1.1.1.) e conservarle in ghiaccio.
   6. Raccogliere singole cellule in 1 μL di 1x PBS utilizzando il micromanipolatore e trasferire le cellule in una provetta contenente la miscela master di lisi cellulare.
      nota: Per trasferire le cellule micromanipolate nel tampone di lisi cellulare, posizionare il capillare direttamente nei 2 μL di soluzione di lisi ed espellere fino a quando non si vedono le bolle.
   7. Far girare brevemente il campione a 2000 x g per 3 s utilizzando un microfuge da tavolo per raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta. Posizionare i campioni sul ghiaccio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 10010-015
Provette Vacutainer EDTA (o Na-eparina)	Bd	366450 (o 366480)	Utilizzato come provetta di reazione per la cattura ex vivo di cellule bersaglio
Pipette Pasteur 150 mm	Vulcano	D810	Utilizzato per l'applicazione a basso volume di celle al C&R
Penna per grasso	Dako	Episodio 2002	Utilizzato su vetrini per mantenere in posizione la sospensione delle celle
Axiovert M200 equipaggiato con Mikromanipulator MMJ e CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Usa la micromanipolazione a portata di mano
Microcapillari (25 μm di diametro), CustomTip Tipo I	Eppendorf	930001201	Utilizzato per la micromanipolazione delle cellule
Provette per PCR da 0,2 mL	Biozima	Codice 710920