Campionamento di singole cellule mediante microdissezione a cattura laser: una tecnica per raccogliere cellule bersaglio da una popolazione cellulare eterogenea

1. Campionamento a cella singola

1. Microdissezione laser
   NOTA: Le singole cellule saranno aggiunte a 4,5 μL di miscela master di lisi cellulare (componenti del kit WGA, della tabella dei materiali e dei reagenti) per WGA.
   1. Preparare la miscela master per lisi cellulare secondo Czyż et al. mescolando 5,0 μL di tampone di reazione, 1,3 μL di ottilfenossipolietossietanolo (soluzione al 10%), 1,3 μL di 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole (soluzione al 10%), risp., 2,6 μL di una soluzione di proteinasi K e 34,8 μL di acqua priva di RNasi/DNasi per ottenere una miscela master per 10 campioni (volume totale 45 μL). Mettere il master mix sul ghiaccio.
      nota: Per più campioni, aumentare i volumi di conseguenza.
   2. Trattare con i raggi UV i vetrini rivestiti con membrana adatti alla microdissezione laser. Posizionare i vetrini in un dispositivo reticolante DNA ed esporli ai raggi UV più alti per circa 10 minuti.
   3. Assemblare il vetrino rivestito di membrana in una citocentrifuga e citocentrifugare l'intera sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.
      nota: Quando si utilizza un sistema in-liquido, in cui le cellule vengono citocentrifugate sul vetrino in soluzione, rimuovere il surnatante dopo la citocentrifugazione e applicare una centrifuga a secco a 1140 x g per 1 minuto.
   4. Procedere direttamente alla microdissezione laser o lasciare asciugare i cytospin all'aria per una notte e congelare i campioni a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
   5. Pipettare 4,5 μL di miscela master di lisi cellulare nel tappo di una provetta PCR da 0,2 mL e raccogliere singole cellule mediante microdissezione laser.
   6. Recuperare la provetta per PCR dal microscopio di microdissezione laser e chiudere la provetta. Raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta con una centrifuga breve e posizionare il campione sul ghiaccio.
   7. Procedere con WGA a cella singola o conservare i campioni isolati a -80 °C per un massimo di 1 mese prima di un'ulteriore elaborazione.