Campionamento di singole cellule mediante microdissezione a cattura laser: una tecnica per raccogliere cellule bersaglio da una popolazione cellulare eterogenea

Abstract

Fonte: Chen S. et al. Pre-arricchimento delle cellule bersaglio e amplificazione dell'intero genoma per la caratterizzazione a valle di singole cellule. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica per ottenere una singola cellula da una popolazione cellulare eterogenea utilizzando la microdissezione a cattura laser. La singola cellula isolata può essere utilizzata per ulteriori studi genomici o per la ricerca sul cancro.

Protocol

1. Campionamento a cella singola

1. Microdissezione laser
   NOTA: Le singole cellule saranno aggiunte a 4,5 μL di miscela master di lisi cellulare (componenti del kit WGA, della tabella dei materiali e dei reagenti) per WGA.
   1. Preparare la miscela master per lisi cellulare secondo Czyż et al. mescolando 5,0 μL di tampone di reazione, 1,3 μL di ottilfenossipolietossietanolo (soluzione al 10%), 1,3 μL di 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole (soluzione al 10%), risp., 2,6 μL di una soluzione di proteinasi K e 34,8 μL di acqua priva di RNasi/DNasi per ottener....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. con L-Glutammina	Thermo Fisher Scientifico	Codice 16600-082	Terreno di coltura utilizzato per le cellule HT-29, adattare il terreno di coltura alla linea cellulare utilizzata per gli esperimenti
Soluzione tampone HEPES (1 m)	PAA	S11-001	Supplemento per il 5A Medium di McCoy
Siero Fetale Bovino Gold	PAA	A15-151	Supplemento per il terreno modificato 5a di McCoy
Penicillina-Streptomicina (100x)	Bioovest	L0018-100	Supplemento per il terreno modificato 5a di McCoy
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 10010-015
Accutase	Bioovest	L0950-100	Soluzione di distacco cellulare (coltura cellulare)
Bagnomaria	GFL	Tipo 1003	Utilizzato per il preriscaldamento di soluzioni
incubatrice	Thermo Fisher Scientifico		Utilizzato per incubare le cellule (coltura cellulare)
Provette di reazione da 50 mL	VWR	525-0403
Miscelatore a rulli	Stuart Scientific	SRT6D	Utilizzato per fissare le celle al filo evitando che le celle si sedimentino
Kit di proliferazione cellulare CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientifico	Codice C34554	Utilizzato per marcare le cellule viventi (etichetta citoplasmatica)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Scientifico	Utilizzato per colorare il DNA (controcolorazione nucleica)
Centrifuga (attrezzata per contenere provette di reazione da 15 mL e 50 mL)	Thermo Fisher Scientifico	Heraeus Megafuge 40R	Utilizzato per celle di pellettatura
Observer Z1 (microscopio a fluorescenza/microdissezione laser)	Carl Zeiss Microimaging		Microscopio invertito (immunofluorescenza) in grado di eseguire la microdissezione laser; I microscopi a fluorescenza devono essere in grado di rilevare Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Utilizzato per il rivestimento di superfici in vetro/plastica
Minishaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Utilizzato per il vortice
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Filo funzionalizzato in grado di isolare e staccare celle EpCAMpositive (detto anche catch&release, C&R)
Aghi per siringhe (G20)	VWR	Codice 613-0554	Utilizzato per forare i cappucci di gomma in modo da consentire il passaggio della parte non funzionale del C&R
Camera di Neubauer	Roth	T729.1	Utilizzato per contare le celle
Pipette Pasteur 150 mm	Vulcano	D810	Utilizzato per l'applicazione a basso volume di celle al C&R
Penna per grasso	Dako	Episodio 2002	Utilizzato su vetrini per mantenere in posizione la sospensione delle celle
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	Codice 1296-003	Utilizzato per l'agitazione durante il distacco della cellula
Provette da 1,5 mL	Eppendorf	30.125.150
Kit Ampli1 WGA	Biosistemi di silicio		Da ordinare tramite Silicon Biosystems
Provette per PCR da 0,2 mL	Biozima	Codice 710920
Citocentrifuga e attrezzature	Hettich	Universale 32	Utilizzare la citocentrifuga a portata di mano
Termociclatore	Bio-Rad	Diade del motore del DNA	È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore con coperchio riscaldato
Microcentrifuga	Roth	CX73.1	Usa la centrifuga da tavolo a portata di mano
Stratalinker UV 1800	Stratagene	400072	Usa il reticolante del DNA a portata di mano