Iniezione intraprostatica di cellule tumorali: una tecnica per fornire cellule tumorali per stabilire un modello murino di cancro alla prostata ortotopico

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione pre-operatoria del topo

NOTA: Ospita i topi nella struttura per animali dell'università per almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico per consentire un adeguato adattamento e ridurre al minimo lo stress degli animali. I passaggi 1.1-1.6 vengono eseguiti dall'assistente del chirurgo. Tutte le fasi chirurgiche successive vengono eseguite dal chirurgo utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici con tecnica sterile.

1. Anestetizzare i topi con isoflurano (2-5% per l'induzione tramite camera, 1-3% per il mantenimento tramite il cono nasale). Verificare l'induzione completa mediante la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita.
2. Pesare i topi e somministrare almeno 0,05 mg/kg dell'analgesico buprenorfina s.c.
   nota: Il peso del mouse ≥20 g è ideale per iniezioni intraprostatiche di successo.
3. Applicare un unguento lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
4. Rasare tutta la pelliccia dall'addome.
5. Sterilizzare l'addome con tre cicli di applicazione circolare di scrub chirurgico utilizzando tamponi sterili non aderenti seguiti da salviettine imbevute di alcol sterili. Lasciare asciugare l'addome.
   nota: Per il resto della procedura chirurgica, devono essere utilizzati solo guanti e strumenti chirurgici sterili per entrare in contatto con l'addome del topo sterilizzato.
6. Trasferisci il mouse supino su una superficie pulita su un termoforo direttamente sotto l'obiettivo di un microscopio operatorio pulito.
7. Copri il topo con un telo sterile con un piccolo foro tagliato sull'addome.

2. Iniezione intraprostatica

NOTA: Esegui tutti i passaggi chirurgici in condizioni sterili. La regolazione del microscopio, del posizionamento del mouse o di qualsiasi altro oggetto non sterile deve essere eseguita con ulteriore assistenza.

1. Eseguire un'incisione di circa 1 cm della pelle esterna lungo la linea mediana dell'addome superiore al pene e alle ghiandole prepuziali (Figura 1D).
2. Separare il tessuto connettivo tra la pelle addominale esterna e la muscolatura addominale interna aprendo le forbici tra gli strati.
3. Eseguire un'incisione simile sui muscoli addominali interni, usando una pinza per sollevare i muscoli per evitare di perforare l'intestino o la vescica (Figura 1D).
4. Localizzare una delle vescicole seminali bilaterali (Figura 1A, bianche)/lobi prostatici anteriori (Figura 1A, neri), che sono spesso posteriori, laterali e leggermente superiori alla vescica (Figura 1A, gialla), ma questo può variare tra i topi. I lobi anteriori della prostata sono traslucidi e attaccati alla curvatura minore delle vescicole seminali bianche.
5. Sollevare delicatamente la punta della vescicola seminale utilizzando la pinza per tessuti Graefe per creare tensione sul tessuto senza perforare la vescicola seminale (Figura 1E).
6. Miscelare la soluzione di matrigel Myc-CaP mediante pipettaggio gentile (eseguito dall'assistente chirurgo), poiché le cellule potrebbero essersi pellettate, e aspirare lentamente 30 μl (1x10⁶ cellule) nell'ago per evitare bolle d'aria.
7. Inserire con cautela lo smusso dell'ago parallelamente all'asse lungo del lobo prostatico anteriore. Iniettare lentamente 30 μl nel lobo e quindi ritrarre lentamente l'ago per evitare perdite (Figura 1F). Verificare un'adeguata iniezione mediante ingorgo del lobo prostatico anteriore (Figura 1G).
8. Tenere con cura la vescicola seminale e il lobo prostatico all'esterno del topo per circa 30 secondi per consentire al matrigel di solidificarsi parzialmente all'interno del lobo. Durante questo periodo, raccogliere eventuali perdite di soluzione cellulare nell'addome utilizzando un applicatore sterile con punta in poliestere per prevenire lo sviluppo di tumori non ortotopici senza premere sul lobo prostatico iniettato.
9. Riposizionare con cautela la vescicola seminale e il lobo prostatico iniettato nell'addome senza esercitare pressione sul lobo. Sostituire eventuali tessuti esternalizzati.
10. Eseguire suture continue per chiudere i muscoli addominali interni con suture ad ago da taglio inverso assorbibili 5-0 vicryl.
11. Eseguire suture interrotte per chiudere la pelle addominale esterna con suture ad ago da taglio inverso 4-0 monofilamento di nylon non assorbibili. nota: Le graffette sterilizzate da 9 mm possono essere utilizzate anche per chiudere la pelle addominale esterna. Tuttavia, a differenza delle suture, interferiscono con qualsiasi successivo segnale di imaging tumorale bioluminescente e fluorescente.
12. Pulisci tutti gli strumenti con salviette sterili all'etanolo (aperte dall'assistente del chirurgo) e mettili in uno sterilizzatore a perle di vetro per 30 secondi. Lascia asciugare gli strumenti prima di utilizzarli sul mouse successivo.
13. Sciacquare la siringa e l'ago in soluzione fisiologica sterile (aperta dall'assistente del chirurgo) per evitare l'intasamento da parte dei residui di matrigel.
    nota: Un assistente chirurgo deve essere presente per tutte le operazioni, eseguendo tutta la preparazione preoperatoria non sterile del topo e la cura post-operatoria del topo, nonché miscelando la soluzione Myc-CaP matrigel prima delle iniezioni. Per ridurre al minimo il tempo, poiché ogni procedura intra-prostatica del topo richiederà 20-30 minuti, l'assistente chirurgo può iniziare a preparare il topo successivo mentre il chirurgo sta suturando il topo attuale.

3. Cura del topo post-operatorio

1. Somministrare 1 mg/kg dell'analgesico meloxicam s.c. immediatamente, 24 ore e 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
2. Lascia che i topi si riprendano in una gabbia senza lettiera posizionata a metà su un termoforo. Monitorare i topi per almeno 30 minuti dopo l'intervento chirurgico fino a quando non riacquistano la normale mobilità e attività, dopodiché metterli in una gabbia pulita con il cibo sul pavimento della gabbia.
3. Inoltre, monitora quotidianamente i topi per la corretta guarigione delle ferite, il peso corporeo, la toelettatura e la deambulazione dopo l'intervento chirurgico. Separare i topi in gabbie individuali in caso di prove di combattimento.
4. Rimuovere eventuali punti di sutura rimanenti entro 14 giorni dall'intervento.

Figura 1: Lobo prostatico anteriore, linfonodi drenanti e tecnica rappresentativa per iniezioni di cellule intraprostatiche. Immagini del lobo prostatico anteriore destro (A) (nero, *), vescicola seminale destra attaccata (bianco), testicolo destro e cuscinetto adiposo (verde) e vescica (giallo), (B) linfonodi para-aortici bilaterali drenanti la prostata (arancione), (C) forbici per microdissezione, pinza Graefe, pinza per tessuti Graefe, un portaago con taglierine e siringa da 50 μL con ago calibro 28 (da sinistra a destra), (D) incisioni sulla linea mediana, (E) esternalizzazione della vescicola seminale e del lobo prostatico anteriore, (F) iniezione intraprostatica e (G) ingorgo del lobo prostatico anteriore.