Generazione di cellule tumorali prostatiche chemioresistenti: una procedura per ottenere cellule tumorali resistenti ai farmaci in vitro

Abstract

Fonte: Mohr, L. et al. Generazione di modelli cellulari di cancro alla prostata di resistenza all'agente anti-mitotico docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive un protocollo per la generazione di modelli cellulari resistenti ai taxani del cancro alla prostata. Questi modelli possono aiutare a studiare le vie coinvolte nella progressione verso la resistenza a Docetaxel nei pazienti con carcinoma prostatico.

Protocollo

1. Generazione di cellule tumorali prostatiche resistenti al docetaxel

NOTA: Eseguire trattamenti cellulari utilizzando la soluzione di Docetaxel utilizzata per la determinazione della concentrazione del farmaco IC50 (preparare in anticipo una quantità sufficiente per l'uso sperimentale). Le cellule parentali devono essere coltivate in parallelo in un piccolo pallone per tutta la durata della procedura ed esposte al mezzo disperdente (DMSO) in volumi corrispondenti, imitando le quantità utilizzate nei flaconi trattati con Docetaxel.

1. Piastra di celle DU145 o 22Rv1 in 2 matracci da 150 cm contenenti 20 mL di terreno (3,5 x 10⁶ celle per matraccio per DU145 e 6,5 x 10⁶ celle per matraccio per 22Rv1). Si consiglia l'uso di 10-20 fiasche di cellule per avere abbastanza cellule alla fine del protocollo.
2. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza (Figura 1B, prima di Docetaxel), aggiungere Docetaxel alla concentrazione IC50 (5 nM per le cellule descritte in questo protocollo).
3. Dopo 72 ore, aspirare i terreni contenenti farmaco e aggiungere terreni freschi privi di Docetaxel (Figura 1B, 72 ore dopo Docetaxel). Cambia il supporto ogni 3-4 giorni. Entro circa 1-2 settimane, i cloni resistenti appariranno evidenti al microscopio (Figura 1B, 7 e 14 giorni dopo Docetaxel).
4. Aspirare il terreno, lavare accuratamente le cellule con 15 mL di PBS e incubare con 4 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3-5 minuti a 37 °C per staccare le cellule dalla superficie del pallone.
5. Risospendere le cellule tripsinizzate dal pallone utilizzando 8 mL di terreno fresco. Pool di celle da tutti i palloni trattati. Celle a pellet per centrifugazione (300 x g, 3 min, RT).
6. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno fresco e piastrarle in² matracci da 150 cm (3,5 x 10⁶ celle per pallone per DU145 e 6,5 x 10⁶ celle per pallone per 22Rv1).
7. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza, aggiungere nuovamente 5 nM di Docetaxel (concentrazione iniziale di IC50).
8. Ripetere i passaggi da 1.3 a 1.6 il giorno 3.
9. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza, trattarle con una concentrazione di Docetaxel 2X IC50 (10 nM per le cellule descritte in questo protocollo).
10. Ripetere i passaggi da 1,3 a 1,8, dopo un aumento della dose delle concentrazioni di Docetaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM e 250 nM), per generare una popolazione stabile di cellule che crescono nei flaconi alla concentrazione finale più alta. Per concentrazioni più elevate, il protocollo di aumento della dose può essere implementato per un massimo di 6 mesi fino al raggiungimento della concentrazione di 1.000 nM (Figura 2A).

Risultati

Figura 1: Generazione di sistemi modello di cellule tumorali prostatiche resistenti al docetaxel.(A) Diagramma che illustra la determinazione del Docetaxel IC50 nelle linee cellulari di cancro alla prostata parentale DU145 e 22Rv1 (Fase 1 del protocollo). Sono incluse le percentuali attese di vitalità cellulare e le concentrazioni di Docetaxel necessarie per l'aumento della dose. Son...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Celle DU145	ATCC	HTB-81
Celle 22Rv1	ATCC	Codice CRL-2505
Docetaxel	Selleck Prodotti chimici	Episodio 1148	in DMSO (10mM)
Pallone per coltura tissutale 150cm^{2}	Falcone	355001
RPMI 1640 Medio	Gibco	11875093	Integrato con il 10% di FBS e 1% Penicilina/Streptomicina
Fondotinta B Siero Fetale Bovino	Gemelli	900208
1X soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Corning	21-040-CM
0,05% di tripsina-EDTA	Gibco	Codice 25300-062
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122