Caratterizzazione della chemioresistenza funzionale: un metodo per valutare la resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali utilizzando il saggio clonogenico

Abstract

Fonte: Mohr, L. et al. Generazione di modelli cellulari di cancro alla prostata di resistenza all'agente anti-mitotico docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive un metodo per valutare la resistenza ai farmaci chemioterapici nelle cellule tumorali della prostata utilizzando il saggio di formazione di colonie. Questo test può essere utilizzato come strumento funzionale per identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari di chemioresistenza nelle cellule tumorali.

Protocollo

1. Caratterizzazione funzionale della resistenza acquisita al docetaxel mediante saggio di formazione di colonie

NOTA: In questo protocollo, la chemioresistenza è stata valutata utilizzando saggi di formazione di colonie. Metodi alternativi utilizzati per valutare la vitalità cellulare (ad esempio, saggi MTS) possono essere utilizzati in base alle preferenze dei ricercatori.

1. Piastra di 2.000 cellule (DU145 o 22Rv1, sia parentale che resistente al docetaxel) per pozzetto in piastre a 6 pozzetti, utilizzando 2 mL di terreno per pozzetto.
2. Dopo 24 ore, aggiungere concentrazioni crescenti di Docetaxel (cellule parentali: 0,25, 0,5, 1, 2,5 e 5 nM; Celle DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM). Per entrambe le linee cellulari DU145 e 22Rv1. Aggiungere DMSO solo a un pozzetto come controllo allo stesso volume utilizzato per la dose più alta di Docetaxel.
3. Dopo 72 ore, aspirare il terreno contenente il farmaco e aggiungere terreno fresco privo di Docetaxel.
4. Incubare le piastre per 1-2 settimane fino a quando le colonie sono visibili al microscopio.
5. Per colorare le colonie, lavarle delicatamente con 2-3 mL di PBS e incubarle con 2-3 mL di soluzione di cristallovioletto (0,1% p/v in 10% formalina) per 20 minuti all'interno della cappa di coltura tissutale o di una cappa aspirante.
6. Rimuovere la soluzione colorante, lavare le piastre con 2-3 mL di H₂O, rimuovere H₂O e asciugare le piastre all'aria.
7. Analizza il risultato visualizzando i pozzetti e contando manualmente le colonie con l'aiuto di un pennarello (per evitare di contare due volte le stesse colonie) e rappresenta la percentuale di vitalità cellulare in un grafico. Scattare immagini digitali delle lastre per la rappresentazione della figura (Figura 1A).

Risultati

Figura 1: Caratterizzazione funzionale e fenotipica dei modelli cellulari resistenti a Docetaxel.(A) Saggi rappresentativi di formazione di colonie di cellule parentali e resistenti al Docetaxel trattate con le concentrazioni indicate di Docetaxel per 72 ore. La percentuale di colonie per ogni concentrazione di trattamento è rappresentata nel grafico incluso. Gli esperimenti sono tri...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Celle DU145	ATCC	HTB-81
Celle 22Rv1	ATCC	Codice CRL-2505
Docetaxel	Selleck Prodotti chimici	Episodio 1148	in DMSO (10mM)
Pallone per coltura tissutale 150 cm²	Falcone	355001
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	Falcone	353046
RPMI 1640 Medio	Gibco	11875093	Integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicilina/streptomicina
Fondotinta B Siero Fetale Bovino	Gemelli	900208
1X soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Corning	21-040-CM
0,05% di tripsina-EDTA	Gibco	Codice 25300-062
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
Cristallo Viola	Sigma-Aldrich	Codice: C0775
Soluzione di formalina al 10%	Sigma-Aldrich	HT501128