1. Preparazione delle cellule per l'imaging dal vivo
- Coltivare cellule CWR22Rv1 che esprimono la catena leggera 3 accoppiata a proteine fluorescenti verdi (LC3-GFP) in terreni di coltura RPMI contenenti il 10% di FBS e l'1% di antibiotici su piastre di coltura rivestite di poli-D-lisina da 35 mm. Le cellule devono essere piastrate a una densità sufficiente per facilitare una rapida proliferazione, ma non così tanto da far crescere eccessivamente le cellule e raggrupparle al momento dell'imaging.
- Trattare campioni cellulari selezionati con DGA (0,3 μg/mL) in PBS.
- Circa 1 ora prima dell'imaging, diluire 1,5 μl di LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) con 20 mL di RPMI contenenti il 10% di FBS e l'1% di antibiotici. Utilizzare soluzioni contenenti DGA per campioni selezionati. Riscaldare tutto il terreno a 37 °C prima di aggiungerlo al piatto di coltura.
- Incubare le cellule con RPMI contenente LysoTracker Red DND-99 per 15-45 minuti a 37 °C.
- Circa 30 minuti prima dell'imaging, accendere l'involucro ambientale WeatherStation e lasciare che si equilibri a 37 °C e 5% di CO2 (con aria umidificata).
- Lavare le celle con PBS e sostituire i terreni con RPMI standard contenenti solo il 10% di FBS e l'1% di antibiotici. Aggiungere ADI ai campioni come indicato.
- Montare piastre di coltura con fondo in vetro di copertura da 35 mm in un adattatore personalizzato (Applied Precision, Inc., WA) e posizionarle sul tavolino del microscopio. Utilizzare olio da immersione (indice di rifrazione 1,520) sulla lente dell'obiettivo 60X 1,42 NA e posizionare il piatto di coltura montato sul tavolino.
2. Microscopia a super-risoluzione, illuminazione strutturata (OMX)
NOTA: Il protocollo in questa sezione si applica all'uso del microscopio a illuminazione strutturata OMX (Applied Precision, WA).
- Accendere l'alimentazione principale e i laser desiderati (410 nm, 488 nm e/o 532 nm). Attendere 20 minuti affinché i laser si stabilizzino termicamente.
- Aggiungere olio da immersione (indice di rifrazione 1,516 per campioni fissi a RT) sulla lente dell'obiettivo 60X 1,42 NA. Se si notano bolle nella gocciolina d'olio, pulire l'obiettivo e aggiungere nuovamente l'olio.
- Posizionare il vetrino sul tavolino e, se necessario, attendere 10 minuti affinché le cellule si depositino sul vetrino coprioggetti.
- Inizializzare il programma di acquisizione. Utilizzare l'illuminazione a fluorescenza per regolare la messa a fuoco fino a quando non è possibile vedere un contorno nitido della cellula.
nota: Prestare sempre attenzione per ridurre al minimo l'esposizione delle cellule all'eccitazione della fluorescenza, fino all'effettiva acquisizione dell'immagine.
- È possibile acquisire una scansione a mosaico a spirale per visualizzare in anteprima aree più grandi del campione per selezionare celle o regioni di interesse. Si consiglia di utilizzare tempi di esposizione brevi (1-10 msec) e una bassa potenza di eccitazione (0,1-1% di trasmissione) durante la scansione del campione o la ricerca dei bersagli.
- Identificare gli autofagosomi mediante fluorescenza GFP-LC3. Identifica i lisosomi con Alexa Fluor 555 anti-LAMP (proteina di membrana associata al lisosoma) e i nuclei cellulari utilizzando DAPI (campioni fissati).
- Scegli le condizioni sperimentali, tra cui la lunghezza d'onda di eccitazione, l'area dell'immagine (ad esempio, 512x512), lo spessore della pila, il tempo di esposizione e la percentuale di trasmissione laser. Per le immagini super-risolte, assicurarsi che l'opzione di illuminazione strutturata sia abilitata. Per la microscopia a deconvoluzione sull'OMX, selezionare l'opzione di illuminazione convenzionale.
- Per ottenere i migliori risultati di ricostruzione, selezionare condizioni sperimentali tali che il conteggio dell'intensità massima sia compreso tra 10.000 e 15.000 durante l'acquisizione. Se il fotosbiancamento è un problema, è possibile utilizzare l'imaging con un'esposizione inferiore (conteggi compresi tra 5.000 e 10.000). Idealmente, i conteggi non dovrebbero diminuire di più di un fattore due durante l'intera acquisizione e dovrebbero essere evitati diminuzioni di oltre un fattore quattro. Se necessario, ridurre lo spessore della pila per garantire un conteggio dell'intensità sostenuto. La fotocamera si satura a 64.000 conteggi, quindi l'intensità massima non dovrebbe mai superare questa cifra. Per buoni campioni, abbiamo riscontrato che le condizioni sperimentali sono un tempo di esposizione di 10~50 msec con una trasmissione laser dell'1%. Sono preferiti campioni luminosi e fotostabili che possono essere riprodotti ripetutamente. Per le immagini in time-lapse e super-risolte è necessaria una macchia stabile.
- Per ridurre il rumore, si consiglia una velocità di lettura di 95 MHz (opzione a velocità media) e un tempo di acquisizione di 2 msec o più. L'aumento degli artefatti si ottiene nell'immagine ricostruita quando il campione si muove durante l'acquisizione. A causa di questo effetto, si consigliano esposizioni brevi per le cellule non aderenti o in rapido movimento.
- L'imaging multicanale può essere eseguito simultaneamente o in sequenza. La modalità sequenziale produce meno diafonia ed è quindi consigliata.
- Per ridurre il fotosbiancamento, si consiglia generalmente di visualizzare prima con lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe (532 nm, 488 nm e poi 410 nm). Tuttavia, per i risultati sperimentali mostrati nella Figura 1, questo ordine è stato invertito (cioè 48 nm, 532 nm e 410 nm) a causa della fotostabilità di questo particolare campione.
- Impostare il limite superiore/inferiore della pila Z spostando il tavolino del microscopio fino a quando la parte superiore/inferiore delle celle non è leggermente sfocata. La distanza desiderata tra ogni immagine deve essere mantenuta costante a 0,125 μm per l'imaging a super risoluzione, poiché il software di ricostruzione considera questo valore come predefinito.
- Ricostruisci le pile di immagini utilizzando SoftWorX (Applied Precision, WA) e analizzale utilizzando VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
