Estrazione e proteolisi delle proteine: un metodo per ottenere proteine da campioni di tessuto tumorale della prostata e la loro digestione enzimatica in peptidi

Abstract

Fonte: Cheng, L. C. et al. Arricchimento di fosfopeptide accoppiato con spettrometria di massa quantitativa senza etichetta per studiare il fosfoproteoma nel cancro alla prostata. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica di estrazione e digestione delle proteine per ottenere peptidi dal tessuto tumorale della prostata. Questi peptidi, in seguito a ulteriori analisi, possono aiutare a identificare nuovi bersagli per l'oncoterapia.

Protocollo

1. Estrazione delle proteine

1. Preparare il tampone di lisi (Tabella 1). (Il volume dipende dal numero di campioni da raccogliere.)
2. Prelievo di tessuti
   1. Pesare il tumore e aggiungere 2 ml di tampone di lisi ghiacciato per ogni 100 mg di tessuto in una provetta di coltura. (In genere, sono necessari da 50 a 150 mg di peso umido del tessuto.)
3. Omogeneizzare il lisato utilizzando un omogeneizzatore portatile o da banco (impulso 2 volte per 15 s). Pulire l'omogeneizzatore prima del primo campione e tra un campione e l'altro utilizzando in successione candeggina al 10%, etanolo al 70% e....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Congelatore a bassissima temperatura	Pananica	in MDF-U76V
Congelatore -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Benna a rotore oscillante	ThermoFisher Scientifico	75004377
Rotatore end-over-end	ThermoFisher Scientifico	415110Q
Provette Eppendorf a basso legame proteico	Eppendorf	22431081
Tripsina, trattata con TPCK	Worthington Biochemicals	LS003740
Lysyl Endopeptidasi	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	Codice 125-05061
MilliQ acqua			acqua deionizzata utilizzata per preparare tutte le soluzioni e i tamponi
Sonic Dismembrator	Fisher Scientifico	FB-120	sonicatore
Sistema Polytron PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	omogeneizzatore