Estrazione e proteolisi delle proteine: un metodo per ottenere proteine da campioni di tessuto tumorale della prostata e la loro digestione enzimatica in peptidi

Abstract

Fonte: Cheng, L. C. et al. Arricchimento di fosfopeptide accoppiato con spettrometria di massa quantitativa senza etichetta per studiare il fosfoproteoma nel cancro alla prostata. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica di estrazione e digestione delle proteine per ottenere peptidi dal tessuto tumorale della prostata. Questi peptidi, in seguito a ulteriori analisi, possono aiutare a identificare nuovi bersagli per l'oncoterapia.

Protocollo

1. Estrazione delle proteine

1. Preparare il tampone di lisi (Tabella 1). (Il volume dipende dal numero di campioni da raccogliere.)
2. Prelievo di tessuti
   1. Pesare il tumore e aggiungere 2 ml di tampone di lisi ghiacciato per ogni 100 mg di tessuto in una provetta di coltura. (In genere, sono necessari da 50 a 150 mg di peso umido del tessuto.)
3. Omogeneizzare il lisato utilizzando un omogeneizzatore portatile o da banco (impulso 2 volte per 15 s). Pulire l'omogeneizzatore prima del primo campione e tra un campione e l'altro utilizzando in successione candeggina al 10%, etanolo al 70% e acqua deionizzata.
4. Per ridurre e alchilare, riscaldare i campioni omogeneizzati a 95 °C per 5 minuti. Quindi, raffreddarli con ghiaccio per 15 minuti. Sul ghiaccio, sonicare il lisato 3 volte (cioè pulsare per 30 s con pause di 60 s tra gli impulsi). A questo punto, il campione non deve essere viscoso o grumoso. Riscaldare il lisato a 95 °C per 5 minuti.
5. Centrifugare il lisato nella stessa provetta di sonicazione utilizzando un rotore a secchiello oscillante a 3.500 x g a 15 °C per 15 minuti. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet.
6. Determinare la concentrazione proteica eseguendo un saggio di Bradford. Se necessario, diluire il lisato a 5 mg/mL con un tampone di lisi. Conservare a -20 °C.
   NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui. Congelare i campioni a -80 °C e utilizzarli per ulteriori analisi.

2. Digestione del lisato

1. Diluire il campione di 12 volte utilizzando 100 mM di Tris (pH = 8,5) per ridurre la quantità di guanidinio. Diluire tutti i campioni allo stesso volume per ridurre al minimo gli effetti di una digestione ineguale. Conservare 12,5 μg di lisato non digerito per confermarlo su un gel colorato con Coomassie.
2. Per 5 mg di proteine, aggiungere 10 μg di Lysyl Endopeptidasi (Lys-C) e incubarla a temperatura ambiente per 5-6 ore. Regolare il pH a 8,0 aggiungendo 1 M di Tris non titolato (pH ~11).
3. Preparare 1 mg/mL di tripsina trattata con L-1-tosilomido-2-feniletilclorometilchetone (TPCK) in 1 mM di HCl (con 20 mM di CaCl₂). Aggiungere la tripsina in rapporto tripsina:proteine 1:100 e incubare a 37 °C per 3 ore.
4. Aggiungere la stessa quantità di tripsina fresca del punto 2.3. Incubarlo a 37 °C per una notte.
5. Conservare 12,5 μg di lisato digerito per confermare la completa digestione su un gel colorato con Coomassie.

3. Estrazione di Fase Inversa

1. Registrare il volume del lisato. Filtrare il campione utilizzando un filtro di cutoff da 15 mL 10 kDa. Centrifugare il campione a 3.500 x g utilizzando il rotore a secchiello oscillante (o 3.500 x g in un rotore ad angolo fisso) a 15 °C fino a quando il volume del retentato è inferiore a 250 μl (questo richiede circa 45-60 minuti). Raccogli il flusso e scarta il retentato.

Tabella 1: Buffer e soluzioni.Questa tabella mostra le composizioni dei tamponi e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

buffer	volume	composizione
Tampone di lisi del cloruro di guanidinio 6 M	50 ml	6 M di guanidinio cloruro, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM di tris (2-carbossietil) fosfina, 40 mM di cloroacetammide, 2 mM di ortovanadato di sodio, 2,5 mM di pirofosfato di sodio, 1 mM di β-glicerofosfato, 500 mg di n-ottil-glicoside, acqua ultrapura a volume
100 mM di pirofosfato di sodio	50 ml	2,23 g di pirofosfato di sodio decaidrato, acqua ultrapura in volume
1M β-glicerofosfato	50 ml	15,31 g β-glicerofosfato, acqua ultrapura a volume
5% di acido trifluoroacetico	20 ml	Aggiungere 1 mL di acido trifluoroacetico al 100% in 19 mL di acqua ultrapura
Acido trifluoroacetico 0,1%	250 ml	Aggiungere 5 mL di acido trifluoroacetico al 5% a 245 mL di acqua ultrapura
tampone di eluizione pY	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 40% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
tampone di eluizione pST	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 50% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
Buffer di binding IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM di cloruro di sodio, acqua ultrapura a volume
25 mM di bicarbonato di ammonio, pH 7,5	10 ml	Sciogliere 19,7 mg in 10 mL di acqua sterile ultrapura, pH a 7,5 con acido cloridrico 1 N (~10-15 μL/10 ml di soluzione), preparare fresco
1M tampone fosfato, pH 7	1.000 ml	423 mL di sodio diidrogeno fosfato 1 M, 577 mL di sodio 1 M idrogeno fosfato
Tampone di equilibratura	14 ml	6,3 mL di acetonitrile, 280 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 1740 μL di acido lattico, 5,68 mL di acqua ultrapura
Tampone di risciacquo	20 ml	9 mL di acetonitrile, 400 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 10,6 mL di acqua ultrapura
Soluzione per spettrometria di massa	10 ml	500 μL di acetonitrile, 200 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 9,3 mL di acqua ultrapura
Buffer A	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 5 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
Buffer B	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 350 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
0,9% idrossido di ammonio	10 ml	300 μl di idrossido di ammonio al 29,42%, 9,7 ml di acqua ultrapura

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Congelatore a bassissima temperatura	Pananica	in MDF-U76V
Congelatore -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Benna a rotore oscillante	ThermoFisher Scientifico	75004377
Rotatore end-over-end	ThermoFisher Scientifico	415110Q
Provette Eppendorf a basso legame proteico	Eppendorf	22431081
Tripsina, trattata con TPCK	Worthington Biochemicals	LS003740
Lysyl Endopeptidasi	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	Codice 125-05061
MilliQ acqua			acqua deionizzata utilizzata per preparare tutte le soluzioni e i tamponi
Sonic Dismembrator	Fisher Scientifico	FB-120	sonicatore
Sistema Polytron PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	omogeneizzatore